Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW
Summary
Utilizzando un vettore binario pBIBAC-GW rende generando piante transgeniche con inserimenti di singola copia intatti, un processo facile. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche di Arabidopsis e prova le piante per integrità e copiare il numero degli inserti.
Abstract
Durante la generazione di piante transgeniche, generalmente l’obiettivo è di avere espressione stabile di un transgene. Questo richiede una singola, intatta l’integrazione del transgene, come multi-copia integrazioni sono spesso sottoposti al silenziamento genico. Il vettore binario compatibile con Gateway basato su cromosomi artificiali batterici (pBIBAC-GW), come altri derivati pBIBAC, permette l’inserimento di transgeni copia singola con alta efficienza. Come un miglioramento per il pBIBAC originale, una cassetta di Gateway è stata clonata in pBIBAC-GW, così che le sequenze di interesse possono ora essere facilmente incorporate nel transfer vettoriale DNA (T-DNA) mediante la clonazione di Gateway. Comunemente, la trasformazione con pBIBAC-GW si traduce in un’efficienza pari a 0,2 – 0,5%, per cui la metà della transgenetica trasportare un’integrazione di singola copia intatta del T-DNA. I vettori di pBIBAC-GW sono disponibili con resistenza al glufosinato-ammonio o DsRed fluorescenza in cappotti di seme per la selezione di piante e con resistenza alla kanamicina come una selezione nei batteri. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche utilizzando pBIBAC-GW: a partire da ricombinando le sequenze di interesse nel vettore pBIBAC-GW di scelta, di piantare trasformazione con Agrobacterium, selezione della transgenetica e prova le piante per integrità e copia il numero degli inserti utilizzando DNA macchiare. Attenzione viene data alla progettazione di una strategia di blotting di DNA riconoscere single – e multi – copia integrazioni ai loci singoli e multipli.
Introduction
Durante la generazione di piante transgeniche, solitamente l’obiettivo è di avere il transgene(s) integrato stabilmente espressa. Questo può essere ottenuto integrazioni intatto copia singola di un transgene. Più integrazioni possono portare all’espressione aumentata di un transgene, ma anche al silenziamento genico. Silenziamento dei transgeni è più probabile se sequenze inserite sono disposti in tandem o ripetizioni invertito1,2,3,4. Vettori binari vengono utilizzati come navette in Agrobacterium-mediata esperimenti di trasformazione per consegnare le sequenze di interesse in genomi delle piante. Il numero di integrazioni in un genoma della pianta è dipenda dal numero di copia del vettore binario in Agrobacterium tumefaciens5,6. Molti vettori binari comunemente utilizzati sono vettori di alta copia e pertanto generare un numero di copie del transgene medio alta: 3.3-4.9 copie in Arabidopsis5.
Il numero delle integrazioni T-DNA può essere abbassato utilizzando vettori binari che hanno un numero di basso-copia di a. tumefaciens, ad esempio BIBAC7, o con il lancio di un T-DNA a. tumefaciens del cromosoma5. Il numero medio di integrazioni del transgene in tali casi è inferiore a 25,8,9,10. A causa di essere copia singola in a. tumefaciens e anche in Escherichia coli, BIBAC-derivati possono mantenere e consegnare costrutti grande come 150 kb11.
GW-compatibile BIBAC vettori10,12 permetterne la facile introduzione di geni di interesse nel vettore utilizzando Gateway clonazione. L’uso della tecnologia Gateway semplifica notevolmente la procedura di clonazione, ma supera anche i problemi più comuni associati con grandi vettori low-copy-number13,14, come un basso rendimento del DNA e una selezione limitata di unica restrizione siti disponibili per la clonazione7,11. I derivati di pBIBAC-GW sono disponibili con una resistenza al glufosinato-ammonio (pBIBAC-BAR-GW) o DsRed fluorescenza in tegumenti (pBIBAC-RFP-GW) per la selezione di piante (Figura 1)10,12. Per entrambi i vettori, un gene di resistenza alla kanamicina viene utilizzato come indicatore di selezione nei batteri.
Combinano i vettori pBIBAC-GW: (1) facile progettazione e manipolazione genetica in e. colie (2) intatto copia singola integrazioni in planta ad alta efficienza. Il rendimento dei vettori pBIBAC-GW integrazioni media 1.7 in Arabidopsis con circa la metà delle piante transgeniche che trasportano un singolo integrato T-DNA10.
Stabile espressione dei transgeni è un requisito per la maggior parte transgenetica generato. L’espressione del transgene stabile può essere ottenuta integrazioni intatti, singola copia. Lavorare con piante transgeniche che trasportano integrazioni intatti, copia singola è, tuttavia, ancora più importante se, ad esempio, lo scopo è lo studio dell’efficienza dei processi basati su cromatina, come mutagenesi, ricombinazione, o la riparazione e la dipendenza di questi processi sulla posizione genomica e struttura della cromatina, al sito di inserimento. Per il nostro interesse, per studiare la dipendenza di mutagenesi oligonucleotide diretto (ODM) sul contesto locale di genomico, un insieme di linee di reporter con integrazioni intatti, singola copia di un gene del reporter di mutagenesi era generato (Figura 2)10. Utilizzando questo set di righe, è stato dimostrato che l’efficienza ODM varia tra i loci transgenici integrati in differenti luoghi genomic, nonostante i livelli di espressione del transgene essendo piuttosto simile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Critica alla generazione transgenica con integrazioni singoli, intatti di un transgene è la scelta del vettore binario utilizzato. Vettori di famiglia BIBAC sono stati utilizzati per fornire sequenze di interesse a molti pianta specie23,24,25,26,27,28. Vettori di BIBAC, tra cui BIBAC-GW, resa singola copia integrazioni con a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è sostenuta dall’olandese Technology Foundation STW (12385), che fa parte dell’organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO), e che è in parte finanziato dal Ministero degli affari economici (OTP Grant 12385 a MS). Ringraziamo Carol M. Hamilton (Cornell University, Stati Uniti) per la fornitura di pCH20, la spina dorsale dei vettori BIBAC-GW.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Riferimenti
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