Generera transgena växter med singel-kopia infogningar använder BIBAC-GW binära vektor
Summary
Använda en pBIBAC-GW binära vektor gör genererar transgena växter med intakt singel-kopia infogningar, en enkel process. Här presenteras en serie av protokoll som guidar läsaren genom processen att generera transgena Arabidopsis växter, och testa växterna för orördhet och antal kopior av skären.
Abstract
När du genererar transgena växter, generellt är målet att ha stabilt uttryck av en transgen. Detta kräver en enda, intakt integration av transgenens, som flera exemplar integrationer utsätts ofta för nedtystning. Gateway-kompatibel binära vektorn baserat på bakteriella artificiella kromosomer (pBIBAC-GW), liksom andra pBIBAC derivat, tillåter införandet av single-kopia transgener med hög verkningsgrad. Som en förbättring av den ursprungliga pBIBAC, har en Gateway-kassett blivit Klonade in pBIBAC-GW, så att sekvenserna av intresse kan nu enkelt införlivas i vektor överföringen DNA (T-DNA) av Gateway kloning. Vanligen, omformningen med pBIBAC-GW resulterar i en verkningsgrad på 0,2 – 0,5%, där hälften av transgena bära en intakt singel-kopia integration av T-DNA. PBIBAC-GW vektorer finns med resistens mot glufosinatammonium eller DsRed fluorescens i frö rockar för urval i växter och motstånd mot kanamycin som en markering i bakterier. Här presenteras en serie av protokoll som guidar läsaren genom processen att skapa transgena växter med pBIBAC-GW: Start från kombinera sekvenserna av intresse i den pBIBAC-GW vektorn val, att plantera förvandling med Agrobacterium, urval av transgena och testa växterna för orördhet och kopiera antal skär med hjälp av DNA analys. Uppmärksamhet ges till att designa en DNA blotting strategi att erkänna singel – och multi – kopieringsskyddad integrationer på enstaka och flera loci.
Introduction
När du genererar transgena växter, är oftast målet att ha den integrerade transgene(s) stabilt uttryckt. Detta kan uppnås genom intakt exemplar integrationer av en transgen. Flera integrationer kan leda till ökat uttryck av en transgen, men också till nedtystning. Ljuddämpning av transgener är mer sannolikt om infogade sekvenserna är ordnade i tandem eller inverterad repetitioner1,2,3,4. Binärt vektorer används som Transfer i Agrobacterium-medierad omvandling experiment för att leverera sekvenserna av intresse i växten genomen. Antalet integrationer till en växt genomet är beroende av kopia antalet binära vektorn i Agrobacterium tumefaciens5,6. Många vanliga binära vektorer är hög kopia vektorer, och därför ger en hög genomsnittlig transgenens kopienumret: 3.3 till 4,9 kopior i Arabidopsis5.
Antalet T-DNA integrationer kan sänkas med hjälp av binära vektorer som har en låg-kopia nummer i A. tumefaciens, såsom BIBAC7, eller genom att lansera en T-DNA från A. tumefaciens kromosom5. Det genomsnittliga antalet transgenens integrationer i sådant fall understiger 25,8,9,10. På grund av att singel-kopia i A. tumefaciens, och även i Escherichia coli, BIBAC-derivat kan upprätthålla och leverera konstruktioner så stor som 150 kb11.
GW-kompatibel BIBAC vektorer10,12 Tillåt lätt införandet av gener av intresse i den vektor som använder Gateway kloning. Användning av Gateway teknik förenklar förfarandet för kloning, men också övervinner vanliga problem associerade med stora låg-kopia-nummer vektorer13,14, till exempel en låg DNA-avkastning och ett begränsat urval av unika begränsning platser tillgängliga för kloning7,11. PBIBAC-GW derivat finns med antingen motstånd mot glufosinatammonium (pBIBAC-BAR-GW) eller DsRed fluorescens i frö rockar (pBIBAC-RFP-GW) för urval i växter (figur 1)10,12. För båda vektorer används en kanamycin motstånd gen som urval markören i bakterier.
PBIBAC-GW vektorerna kombinera: (1) lätt design och genmanipulation i E. coli, och (2) intakt singel-kopia integrationer i planta med hög effektivitet. PBIBAC-GW vektorer avkastningen på genomsnitt 1,7 integrationer i Arabidopsis med ungefär hälften av de transgena växter som bär en enda integrerad T-DNA10.
Stabilt uttryck av transgener är ett krav för de flesta transgenics genereras. Stabil transgenens uttryck kan uppnås genom intakt, singel-kopia integrationer. Arbeta med transgena växter transporterar intakt, singel-kopia integrationer är dock ännu viktigare om exempelvis syftet är att studera effektiviteten av kromatin-baserade processer, såsom mutagenes, rekombination, eller reparation och beroendet av dessa processer på genomisk platsen och kromatinstruktur vid insticksstället. För vårt intresse, för att studera beroendet av oligonukleotiden riktad mutagenes (ODM) på lokala genomisk sammanhang, var en uppsättning reporter rader med intakt, singel-kopia integrationer av en mutagenes reporter gen genererade (figur 2)10. Med denna uppsättning linjer, visades att ODM effektivitet varierar mellan transgena loci integreras på olika genetiska platser, trots transgenens uttrycksnivåerna är ganska likartade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska till att generera transgenics med enda, intakt integrationer av en transgen är valet av den binära vektor som används. BIBAC familj vektorer har använts för att leverera sekvenser av intressen till många växt arter23,24,25,26,27,28. BIBAC vektorer, inklusive BIBAC-GW, avkastning singel-kopia integrationer med …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av den holländska Technology Foundation STW (12385), som är en del av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO), och som delvis finansieras av departement av ekonomiska angelägenheter (OTP Grant 12385 till MS). Vi tackar Carol M. Hamilton (Cornell University, USA) för att tillhandahålla pCH20, ryggraden i BIBAC-GW vektorer.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Riferimenti
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
