Denne metode giver mulighed for generation af tetraploide og triploid Caenorhabditis nematoder fra enhver diploide stamme. Polyploide stammer, der er genereret af denne metode har været brugt til at studere kromosom vekselvirkninger i meiotiske prophase, og denne metode er nyttig til at undersøge vigtige grundlæggende spørgsmål i celle, udviklingsmæssige, evolutionær, og kræft biologi.
Mekanismer, der indebærer samlede genom polyploidi spiller en vigtig rolle i udvikling og evolution; også, en unormal generation af tetraploide celler har været forbundet med både progression af kræft og udviklingen af resistens over for lægemidler. Indtil nu har det ikke været muligt at nemt manipulere Ploidi hos en flercellede dyr uden at generere det meste sterile afkom. Præsenteres her er en enkel og hurtig protokol til at generere tetraploide Caenorhabditis elegans dyr fra enhver diploide stamme. Denne metode gør det muligt for brugeren at oprette en bias i kromosom segregation under meiose, i sidste ende øge Ploidi i C. elegans. Denne strategi bygger på en forbigående reduktion af udtryk af rec-8 for at generere diploide kønsceller. En rec-8 mutant producerer diploide kønsceller, der potentielt kan producere tetraploids efter befrugtning. Denne tractable ordningen har været anvendt til at generere tetraploide stammer bærer mutationer og kromosom rearrangementer at få indsigt i kromosomale dynamics og interaktioner under parring og synapsis i meiose. Denne metode er effektiv til at generere stabile tetraploide stammer uden genetiske markører, kan anvendes på enhver diploide stamme og kan bruges til at udlede triploid C. elegans. Denne enkle metode er nyttig for at undersøge andre grundlæggende biologiske spørgsmål relevant for genom ustabilitet gen dosering, biologiske skalering, ekstracellulære signalering, tilpasning til stress, udvikling af resistens over for lægemidler, og mekanismer for artsdannelse.
Samlede genom polyploidi findes overalt i naturen og er ofte et nødvendigt skridt i tilpasning, artsdannelse, organogenesis, sårheling og biologiske skalering; Det er også kendt for at fremme både kræft og resistens over for lægemidler1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. landbrugs- og fiskeriprodukter industrier generere polyploide planter, fisk og skaldyr af kemisk behandling (f.eks., colchicin og orzalin) til at opnå hurtigere vækstrater og bulkier afgrøder og husdyr13, 14,15. Eksperimenterende og ineffektiv produktion af tetraploids findes for mus og zebrafisk model systemer16,17. Dog er de fleste eller alle polyploide flercellede dyr genereret embryonically dødelige eller sterilt og dermed ikke ideel til laboratorieundersøgelser af virkningerne af polyploidi i en flercellet organisme. Derfor, enhver forståelse af hele genom polyploidization i flercellede organismer har været begrænset til nærtbeslægtede arter fra evolutionære nylige polyploidization begivenheder18,19,20 . En sti til at fremme forespørgsler af den biologiske rolle eller konsekvenserne af polyploidization er brugen af C. elegans modelsystem. Vigtigere, C. elegans er en tractable genetiske system, der normalt findes som en diploid, indeholder kun fem autosome (A) og en sex kromosom (X) pr. genom, er gennemsigtig giver mulighed for i vivo observation af biologiske processer og har en kort levetid på 3-4 dage (fra æg til seksuelt modne voksne). C. elegans har vist sig at være i stand til at reproducere som en tetraploide, som er den mest almindelige type af hele genom polyploidi i naturen. Triploid dyr kan genereres ved at krydse tetraploids med diploids, men deres Ploidi er ikke stabil, og stammer blive diploide inden for et par generationer.
I de sidste par årtier kun en håndfuld af levedygtige og frugtbare C. elegans tetraploids stammer var isoleret i laboratoriet, ved hjælp af en strategi, der er besværlige og genererer kun begrænset typer stammer21,22,, 23. denne strategi genererer C. elegans tetraploids af varme-chok behandlinger, som formentlig påvirker kromosom adskillelse i gameter, efterfulgt af en screening for formodede polyploide dyr ved hjælp af genetiske markører. Disse tetraploids var yderst nyttigt i undersøgelsen af hvordan denne nematode bestemmer, om at blive mandlige eller hermafrodit. Senere undersøgelser brugt de tilgængelige stammer til at undersøge vækst, gen dosis og regulering af synapsis under meiose i denne nematodeprøveudtagning21,24,25,26. Desværre, disse studier var begrænset af vanskeligheden i at generere nye tetraploide stammer og baggrunden genetiske markører disse stammer indeholdt. Vist her er en enkel og hurtig protokol til at generere stabile tetraploids, som er blevet brugt til at generere stammer for at studere regulering af synapsis under meiose27.
Som i naturen, kan der opstå polyploidization af dannelsen af diploid i stedet for haploide kønsceller. Vores konklusion, at en meiose-specifikke cohesin komponent mutant rec-8 genererer diploide sperm og oocyter oplyste, at banke ned rec-8 gen ville resultere i produktionen af tetraploide afkom (figur 1)27, 28,29. Generere tetraploide stammer blot indebærer banke ned rec-8 af RNA-interferens (RNAi) for to generationer for at phenocopy rec-8 mutant diploide kønsceller. Formodede polyploids let kan identificeres ved deres længere end normal kropsstørrelse. Polyploids er bekræftet som hel eller delvis tetraploids ved at tælle antallet af kromosomer per kerne, når stabil linjer er etableret.
Den strategi, der er beskrevet her gør det muligt for generation af stabil tetraploide Caenorhabditis ødelægge stammer fra indledende diploide genetiske baggrund eller karyotype uden brug af genetiske markører. Da denne protokol er mere effektive, alsidige og enkle end ordningen for tidligere brugt, vil det udvide de nødvendige værktøjer til forespørgsel polyploidization i fundamentale processer til udvikling, genom stabilitet og udviklingen i flercellede roller organismer. Kun overskuelig begrænsning i anvendelsen af denne protokol er i genetiske baggrunde resistente over for RNAi.
Produktion af haploide (n) gameter er nøglen til at generere en diploid (2n) zygote på befrugtning. Denne reduktion af genomet er gennemført under meiose med to på hinanden følgende celledelinger efter en enkelt genome dobbeltarbejde. For at skabe haploide kønsceller, C. elegans, som med de fleste andre metazoans, adskille maternally og formynderisk afledt homologs i første division, mens Søster kromatider fra hver homolog adskille i anden division. En måde at hele genom polyploidi opstår i naturen er gennem generation af kønsceller, der undlader at halvdelen af deres genom størrelse under meiose.
Det har været kendt i over 50 år at tetraploide C. elegans nematoder er levedygtig og frugtbar. Nigon23, og senere Madl og Herman22, genereres og identificeret en håndfuld C. elegans tetraploids ved at forstyrre meiotiske kromosom adskillelse ved hjælp af heat-shock behandlinger og brug af genetiske markører, henholdsvis. En enkelt yderligere C. briggsae tetraploide stamme blev afledt ved hjælp af denne protokol over 30 år senere24. Disse tetraploids blev udnyttet til at undersøge, hvordan C. elegans bestemme, om at blive mandlige eller hermafrodit, hvordan Ploidi regulerer vækst og størrelse, og at analysere parring og synapsis i meiose25,26, 38 , 39 , 40. men disse og andre undersøgelser, kræver anvendelse af specifikke tetraploids eller triploid stammer var begrænset af vanskeligheden i at generere tetraploide stammer af denne metode.
Protokollen beskrevet her giver mulighed for generation af stabil fuld 4A, 4 X og delvis 4A, 3 X tetraploide Caenorhabditis nematodeprøveudtagning stammer fra en indledende diploide genetiske baggrund eller karyotype uden brug af genetiske markører.
Tetraploidy kan opstå ved mere end én mekanisme i C. elegans:
Madl og Herman foreslog at de tetraploide stammer de genererede sandsynligvis stammer fra en midlertidig tilstand mellem triploid. Deres stammer blev opnået gennem udvælgelse over flere generationer eller ved at krydse den formodede triploide mellemliggende med diploide hanner22. Defekter i kromosom partitionering i rec-8 mutanter, giver anledning til diploide oocyter og sperm foreslå en anden mulig mekanisme som tetraploide dyr kan opstå med rec-8 RNAi ordningen27.
Rec-8 RNAi behandlet hermafroditter kunne producere diploide oocyter og spermatocytes, der ville give anledning til tetraploide dyr efter befrugtning. Overensstemmelse med denne mulighed er det faktum, at nogle af de klonede F2 hermafroditter gav anledning til stabil Lon stammer i den næste generation, der tyder på, at de klonede Lon F2 hermafroditter hvor allerede tetraploide. I ordningen passage er den første generation af rec-8 RNAi behandlet hermafroditter krydset med ubehandlet hanner. Diploide spermatocytes kunne stadig opstå hos mænd fordi korset er gennemstegt i nærværelse af bakterier udtrykker rec-8 dsRNA og dermed, mænd er udsat for rec-8 RNAi under parring i mindst 3 dage. Derfor, Lon polyploids i horisontal ordningen kunne også have dannet fra befrugtning af diploide oocytter af diploide sperm. Stabil tetraploide stammer kan opstå fra enten befrugtning mellem diploide kønsceller eller krydser triploid dyr der indeholder oocytter af variable Ploidi med diploide dyr producerer haploide sædceller.
Vigtige overvejelser:
Self-versus krydsning ordninger:
Ordningen for selvstændige befrugtende rec-8 RNAi behandlet F1 hermafroditter og ordningen vedrørende krydsning af behandlede hermafroditter med ubehandlet hanner begge gav anledning til 4A, 4 X og 4A, 3 X tetraploide stammer. Selv om flere polyploids blev oprindeligt isoleret fra ordningen for selvstændige gødskning, flere af disse polyploide dyr var sterilt og dermed begge ordninger er ligeledes effektiv til at producere tetraploide stabil stammer. Årsag til øget succes og sterilitet hos den selvstændig gødskning ordningen er fortsat ukendt. Selv om begge ordninger er ligeledes effektiv, er ordningen for selvstændige gødskning lettere, da det ikke kræver isolering af hanner for parring. Derudover når stamme af interesse er ineffektive eller defekt på parring, ville den selvstændige gødskning ordning være at foretrække. Horisontal ordningen kan bruges til at generere komplekse tetraploids der indeholder mere end to versioner af et enkelt kromosom.
Ændringer og begrænsninger:
I øjeblikket, omfatter denne protokol rec-8 RNAi behandling af fodring bakterier at udtrykke dsRNA til rec-8 -genet. Denne protokol virker således ikke i Caenorhabditis arter ikke reagerer på RNAi af fodring eller i mutanter defekt i miljømæssige eller systemisk spredning af RNAi mellem væv41,42,43. Dette problem kunne potentielt løses ved at indføre RNAi behandling ved direkte injektion af dsRNA af interesse direkte i germline.
Triploid dyr skal genereres ved at krydse en tetraploide til en diploide dyr, hvorfra det stammer, fordi denne ordning ikke generere stabile triploid stammer44,45. Kun 15% af æggene far af triploids hatch, og deres afkom er for det meste sterile afkom på grund af aneuploidi. Derudover er få overlevende frugtbare afkom har tendens til at være fuldstændig eller i nærheden af diploids inden for et par generationer. Dette er sandsynligvis, i det mindste delvis, fordi oocyter delvist korrigere trisomi af adskillelse den tredje kromosom i selve polar i den første meiotiske deling.
En uovervindelig begrænsning af denne protokol er at det ikke virker for at gøre tetraploids af mutanter, der påvirker komponenter af RNAi-maskiner, fordi de er resistente over for RNAi behandling46.
Fejlfinding:
REC-8 RNAi:
Et par overvejelser er afgørende for denne protokol skal lykkes. Først er at bruge friske IPTG og frisklavet IPTG NMG plader til induktion af rec-8 dsRNA produktion i bakterier HT115 bakterier transporterer rec-8 (W02A2.6)-klon. IPTG er lysfølsomt og det er vigtigt at reducere lys eksponering til plader. IPTG plader kan lagres til én måned ved 4 ° C i mørke. Andet, rec-8 (W02A2.6) RNAi bakterielle HT115 stammer fra Ahringer biblioteket (Kamath og Ahringer 2003) givet en stærkere rec-8 fænotype end andre tilgængelige rec-8 HT115 kloner.
Tetraploide stamme vedligeholdelse:
Tetraploide stammer vokser meget langsomt og producere på de fleste 50 afkom pr. generation47. Alle identificerede tetraploide stammer er relativt stabile, men de kan bryde og blive diploide når understregede (Jonathan Hodgkin personlig kommunikation og vores upublicerede observationer). Derfor er det vigtigt at bemærke, at når tetraploide stammer er vokset ved 25 ° C, varme-chokeret, udsultet, eller frosset og optøet, de kan hurtigt vende tilbage til diploidy, så det er vigtigt at fortsætte med at vælge Lon dyr når optøning disse stammer, eller når udsætter disse stammer til stressende forhold, der kan få dem til at vende tilbage.
Mulige applikationer:
Undersøgelse af effekten eller rollen, som samlede genom polyploidization i evolution, celle cyklus, genekspression og udvikling i flercellede organismer har påberåbt sig sammenligninger mellem: celler i en organisme, der indeholder forskellige Ploidi, den samme celle typer i nært beslægtede arter med forskellige Ploidi eller arter, der har undergået evolutionært seneste polyploidization begivenheder og fysisk isolation3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Selv om tetraploids kan udledes af zebrafisk og mus modelsystemer, er deres afkom sterile eller embryonically dødbringende16,17. Derudover disse modelsystemer har lange livscyklusser sammenlignet med C. elegans, og de tilgængelige metoder til at generere polyploide dyr er komplekse og ineffektive. C. elegans stammer, der er afledt af denne metode vil derfor være afgørende for at fremme enhver undersøgelse på effekter og roller af hele genom polyploidi i flercellede organismer.
Da en triploide kan være afledt af en tetraploide ved at krydse tetraploide til den oprindelige diploid, giver en sammenligning mellem diploids, triploids og tetraploids, der kun adskiller sig i antallet af kopier, genom, en unik og enestående mulighed for at evaluere tilsvarende dyr/organer/celler med forskellige genom størrelse (eller gen dosis). Fleksibiliteten og brugervenligheden af ordningen beskrevet her har tilladt os at generere snesevis af tetraploide stammer fra forskellige genetiske diploide baggrunde eller karyotypes. Nogle af disse stammer blev allerede brugt til forespørgsel mekanismer af homologe kromosom parring og synapsis under meiose27.
Vildtype og mutant tetraploide stammer transporterer fluorescerende markører vil give nye veje til undersøgelse for at forstå forholdet mellem genom størrelse og nukleare/cytosol ratio på intracellulære/cellulære/orgel og hele dyret skalering, samlede genom polyploidization om tilpasning, artsdannelse, gen dosis og udtryk og udvikling af væv og orgel. Ud over undersøgelsen af biologiske skalering vil generation af tetraploide stammer betydeligt yderligere forespørgsler af grundlæggende biologiske spørgsmål vedrører ekstracellulære signalering, genom ustabilitet, endoreduplikation, samlede genom dobbeltarbejde, gen dosering, tilpasning til stress, udvikling af resistens over for lægemidler, og mekanismen artsdannelse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Caenorhabditis genetik Center (finansieret af National Institute of Health (NIH) Office for forskning infrastruktur programmer P40 OD010440) for stammer. Forfatterne vil gerne takke Baptiste Roelens og Eli Lessman, for at forsyne os med konstruktiv feedback og Mano Lab på CCNY, CUNY for brug af deres laboratorium for en del af optagelserne og for deres bistand. Dette arbejde blev støttet af en PSC-CUNY award TRADB-46-113 og NIH give 1SC2GM118275-01. M.S. blev delvist støttet af canadiske Institut for sundhed (CIHR) postdoc stipendium, og E.K. blev støttet af NIH/NIGMS STIGE give GM062981.
Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NGM agar plates | |||
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Culture | |||
LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LB Agar plates | |||
LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotics | |||
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
DAPI | Biotium | 40011 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol Fixation | |||
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
M9 Buffer | |||
Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNAi Clones | |||
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |