שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות
Summary
Pseudomonas aeruginosa זיהום גורם תחלואה משמעותית מארחים פגיע. Nonredundant transposon ההכנסה מוטציה הספרייה של זן aeruginosa פ PA14, כמנהל PA14NR להגדיר, מקלה על ניתוח של ג’ין פונקציונליות בתהליכים רבים. המוצג כאן הוא פרוטוקול כדי ליצור עותקים באיכות גבוהה של ספריית מוטנטים PA14NR להגדיר.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa הוא phenotypically, genotypically מגוונת וישימה גראם שליליים חיידק נפוץ בסביבות אנושי. Aeruginosa פ הוא מסוגל ליצור biofilms לפתח עמידות לאנטיביוטיקה, לייצר הגורמים התקפה אלימה, להתפתח במהירות במהלך זיהום כרוני. לפיכך aeruginosa פ יכול לגרום הן אקוטית, כרונית, קשה לטפל בדלקות, וכתוצאה מכך תחלואה משמעותית באוכלוסיות מסוימות החולה. זן aeruginosa פ PA14 הוא בידוד קליני האדם עם מבנה הגנום שנשמרת מדביק מגוון רחב של מחשבים מארחים יונקים ו nonvertebrate, שהופך PA14 זן אטרקטיבי ללמוד את הפתוגן. בשנת 2006, נוצרה מוטציה nonredundant transposon ההכנסה ספריה המכילה מוטציות 5,459 המקביל 4,596 גנים PA14 החזוי. מאז, הפצה של הספרייה PA14 אפשרה את קהילת המחקר להבין טוב יותר את הפונקציה של גנים יחידניים מסלולים מורכבים של aeruginosa פ. שמירה על תקינות הספרייה באמצעות תהליך השכפול דורשת טכניקות טיפול נכונה ומדויקת. לשם כך, כתב יד זה מציג פרוטוקולים המתארים בפרוטרוט השלבים המעורבים ספריית שכפול, בקרת איכות ספריית ואחסון נאות של מוטציות בודדות.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa הוא phenotypically, genotypically מגוונת וישימה גראם שליליים חיידק נוכח קרקע, מים, סביבות האנושי ביותר, כמו גם microflora העור. בהשוואה למינים רבים של חיידקים, aeruginosa פ יש גנום גדולה יחסית של Mbp 5.5-7 עם גבוהה G + C תוכן (65-67%). יתר על כן, חלק ניכר את הגנים מעורבים הסתגלות מטבולית, חלק רשתות רגולטוריות, המאפשרות גמישות רבה בתגובה עקה1. פ aeruginosa מבטא שפע של הגורמים התקפה אלימה, תערוכות נטייה כדי ליצור biofilms, הנו היכולת לתאם בין תגובות דרך חישת מרובים מסלולים ו מציג קיבולת הבולטים לפתח עמידות לאנטיביוטיקה סובלנות2,3,4,5,6,7,8. תכונות אלה מציגים אתגרים משמעותיים לטיפול זיהומים הנגרמים על ידי aeruginosa פ.
כרוניות זיהומים aeruginosa פ יכול להתרחש מצבי מחלה רבים. סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה גנטית נגרמת על ידי מוטציה של הגן סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR) , התוצאה היא הפרשות inspissated, נגועים בתוך האוויר, ברונכיאקטזיס מתקדמת ובסופו של דבר, למוות כשל נשימתי9. מאת לבגרות, הרוב המכריע של חולים עם CF כרוני נגוע aeruginosa פ, אשר ממלא תפקיד מפתח התחלואה והתמותה הקשורים למחלה זו10. בנוסף, חולים עם כוויות חמורות הפציעות11, tracheostomies12, החלפות פרקים13או קטטרים שכנה14 הם בסיכון לזיהום aeruginosa פ הקשורים ליכולת של החיידקים טופס biofilms ולברוח לארח תגובות דלקתיות15. יתרה מזאת, קולוניזציה מתרחשת ללא תחרות לאחר אוכלוסיה עמידים בפני אנטיביוטיקה מרובות או סובלנית נבחרה דרך טיפול מיקרוביאלית רחבת ספקטרום רציף12,16,17 , 18. הבנה טובה יותר בפתוגנזה של aeruginosa פ יהיו השלכות משמעותיות על מצבי מחלה רבים.
מספר aeruginosa פ קליניים מבודד, כולל זנים PAO1, PA103, PA14, פאק, נחקרו בהרחבה לחקור תכונות שונות של פתוגנזה aeruginosa פ . זן PA14 הוא בידוד קליניים שייך לאחד הנפוצים המשובטים קבוצות ברחבי העולם19,20 , לו לא היה בהרחבה passaged במעבדה. PA14is מאוד מידבק במודלים חוליות של זיהום, עם אנדוטוקסין הבולטים פרופיל21, pili מבנה22, פתוגניות איי23, הקלד מערכת הפרשת השלישי (TTSS), cytotoxicity כלפי מידע יונקים תאים24 ו פרופילים עמידות והתמדה לאנטיביוטיקה25. יתר על כן, PA14 הוא גם מאוד מידבק במערכות דגם פתוגן-פונדקאי רבים, כולל צמח העלה הסתננות מודלים26,27, זיהוםCaenorhabditis elegans מודלים28, 29, חרק מודלים30,31, כמו גם דלקת ריאות העכבר דגמי32,33 , צריבה בעור מודלים34.
ספריות מוטציה הגנום כולו הן אוספים של isogenic מוטציות בגנים חיוניים מהווה כלי רב עוצמה כדי להבין את הביולוגיה של אורגניזם בכך שהוא מאפשר ניתוח של ג’ין פונקציה בקנה מידה גנומית. שני transposon ליד, הרוויה ההכנסה מוטציה ספריות שנבנה ב פ aeruginosa זמינים כעת להפצה. האתרים ההכנסה של טרנספוזונים שנקבע עבור שתי ספריות. ספריות nonredundant כביכול אלה להקל על מחקרים ברמת הגנום של זני חיידקים על ידי להקטין במידה ניכרת את הזמן ואת עלות מעורב ההקרנה uncharacterized מוטציות אקראיות transposon. Aeruginosa פ PAO1 transposon מוטציה הספרייה, שנבנה ב MPAO1 לבודד את זן PAO1 באמצעות טרנספוזונים ISphoA/ הא והואlacZ/ הא35, היא נאצרה על ידי המעבדה Manoil, אוניברסיטת וושינגטון. הספרייה כוללת תבדוק-רצף אוסף של מוטציות transposon 9,437 מספק כיסוי הגנום רחב וכולל שתי מוטציות של גנים רוב36. מידע אודות ספריית מוטנטים של transposon PAO1 aeruginosa פ הוא ציבורי, נגישים לאינטרנט Manoil המעבדה באתר-http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. Aeruginosa פ זן PA14 nonredundant transposon ההכנסה מוטציה ספריה (מוגדר PA14NR) נבנה בזן PA14 באמצעות MAR2xT7 ו- Tn טרנספוזוניםphoA37 מופץ כיום על ידי המחלקה לרפואת בבית החולים הכללי במסצ’וסטס. ערכת PA14NR כוללת אוסף של יותר מ- 5,800 מוטציות עם הוספות transposon יחיד בגנים חיוניים37. פרטים על הקמה של ערכת PA14NR מתוארים http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB אתר ציבורי, אינטרנט נגיש, אשר כולל גם מגוון רחב של כלי חיפוש באינטרנט כדי להקל על השימוש PA14NR הגדר.
ערכת PA14NR המקורית כללה מוטציות 5,459, שנבחר מתוך ספרייה מקיפה של 34,000 transposon אקראיים ההכנסה מוטציות, התואמים 4,596 גנים PA14 החזוי המייצגים 77% של כל החזוי PA14 גנים37. מאז הקמת הספרייה בשנת 2006 נוספו המוטנטים החדשים וכוללת כיום ערכת PA14NR 5,800 יותר מוטציות38 המייצגים כ-4,600 מינים גנים PA14. רוב המוטציות transposon PA14 נוצרו על רקע פראי סוג37. פרטים על כל חבר של ספריית מוטנטים, כולל רקע גנטי, זמינים דרך חיפוש במסד הנתונים המקוון, או על-ידי הורדת את הגיליון האלקטרוני של ספריית Nonredundant, שתי תכונות זמין באתר האינטרנט של PA14 (http:// pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi). רוב המוטציות שנוצרו באמצעות MAR2xT7 של transposon (MrT7), עם קבוצה קטנה שנוצרו באמצעות transposon TnPhoA (phoA)37. בכל transposon יש קלטת של עמידות לאנטיביוטיקה, המאפשר בחירה מוטציה באמצעות גנטמיצין (MrT7) או kanamycin (phoA). ערכת PA14NR של מוטציות מאוחסן בשישים ושלוש 96-ובכן צלחות, כולל בקרה 96-ובכן נוספים שני לוחות, המורכבים מסקטור פראי סוג PA14 מחוסן, בארות uninoculated intercalated בתבנית מוגדרת מראש. התבנית 96-ובכן צלחת לזווג עם כלי החיפוש באינטרנט מאוד מקלה על התפתחות אישית הקרנת מבחני המאפשרים למשתמשים בקלות לזהות גנים הקשורים פנוטיפים מוטציה. כלי החיפוש המקוון להקל גם לחיפוש ובחירת ושכמותי רלוונטיים נוספים הנדרשים ללימודי.
PA14, PAO1 transposon מוטציה הספריות הן במשאבים גלובליים חשוב מאוד עבור הקהילה המדעית, הם משלימים אחד את השני אימות את התפקוד של הגנים לא ידוע מסלולים של פתוגן חיידקי הזה. בצירוף מקרים, מאז הקמת ספריות מוטציה transposon של PAO1 ו- PA14, מלא הגנום אנליזת רצפי דנ מבודד aeruginosa פ רבים הראו כי PAO1 ו- PA14 שייך שונים subclades הגדולות של aeruginosa עמ’ האמיניות7,39,40,41. כי קליניים aeruginosa פ מבודד נמצאים מופצים ברחבי האמיניות, העובדה כי PAO1 ו- PA14 שייך שונים aeruginosa פ תת-קבוצות המעלה את ערכו של מוטציה transposon שתי ספריות עבור השוואתי מחקרים.
פרסומים המתארים את הבנייה וסינון של ספריות מוטציה חיידקיים, כולל ספריות aeruginosa פ 35,37,42, זמינים בקלות בספרות. עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, אין פרוטוקולים שפורסמו המתארת הליכים מפורטים ואת טכניקות המשמשות לצורך שכפול, תחזוקה, אימות של חיידקי ספריות מוטציה הינם זמינים.
המתודולוגיה המתוארים בפרסום זה מתאר קבוצה של פרוטוקולים שלושה המאפשרים שימוש ותחזוקה של ערכת PA14NR. הפרוטוקול הראשון מתאר שכפול של הספרייה כמומלץ לנמענים של ערכת PA14NR. פרוטוקול השני כולל הנחיות ומבטא, גדל, ואחסון מוטציות בודדות מזוהה באמצעות ערכת PA14NR. הפרוטוקול השלישי מתאר טכניקות בקרת איכות, כולל PCR הגברה של קטעים מן transposon מוטציות ורצף הבאים כדי לאשר את הזהות מוטציה. זו קבוצה של פרוטוקולים עשוי גם להיות מותאם שכפול ותחזוקה של חיידקי ספריות מוטציה או אוספים אחרים. השכפול של חיידקי ספריות מוטציה או אוספים מומלץ מאוד כדי לשמור על השלמות של “העותק הראשי” (העותק המקורי קיבל). שכפול של מספר עותקים של ערכת PA14NR לשימוש מעבדה שגרתיות ממזער את ההסתברות של זיהום interwell של העותק הראשי.
Protocol
Representative Results
Discussion
P. aeruginosa PA14NR הינו משאב יקר ערך עבור הקהילה המדעית. לפי לערכת 2017/03 ממסד חיוני אינדיקטורים המדע של Clarivate Analytics,. Liberati et al. (2006) 37, אשר מתאר את בניית ערכת PA14NR, היא מדורגת במקום 1% העליונים של מיקרוביולוגיה פרסומים. Google Scholar דוחות. מעל 600 אזכורים של. Liberati, et al. (2006) לכתב הי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ליסה Philpotts של הספריה הווירטואלית טריידוול MGH להנחיה שלה חפש את מסד הנתונים. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד סיסטיק פיברוזיס (YONKER16G0 ו- HURLEY16G0) NIH NIAID (BPH ואייד: R01 A1095338).
Materials
| Materials for Library Replication | |||
| Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 | Corning Life Sciences | 353072 | via Fisher Scientific |
| Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 | Corning Life Sciences | 3960 | via Fisher Scientific |
| Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 | Thermo Scientific Rochester | 242811 | via Fisher Scientific |
| Rectangular Ice Pan, Midi (4L) | Corning Life Sciences | 432104 | via Fisher Scientific |
| Secure-Gard Cone Mask, case of 300 | Cardinal Health | AT7509 | via Fisher Scientific |
| AluminaSeal, pack of 100 | Diversified Biotech | ALUM-100 | via Fisher Scientific |
| Breathe-Easy membrane, pack of 100 | Diversified Biotech | BEM-1 | via Sigma-Aldrich |
| Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 | Sorenson | S50100 | via Westnet Incorporated |
| Plate roller | VWR | 60941-118 | via VWR |
| Cryo Laser Labels – CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets | GA International | RCL-11T1-WH | via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com) |
| 96-well replicator | V & P Scientific, Inc. | Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long | via V & P Scientific, Inc. |
| Multitron Pro, 3mm Shaking incubator | Infors HT | l10003P | via Infors HT |
| Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette | Sartorius | 735491PR | via Sartorius |
| Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 | Biohit | 14-559-512 | via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips |
| Dry Ice | User-specific vendor | ||
| Materials for Individual Mutant Storage | |||
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| Pipettes (P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | via Gilson |
| Materials for Quality Control PCR | |||
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | via ThermoFisher |
| PCR Thermocycler | |||
| Omnistrips PCR Tubes with domed lids | Thermo Scientific | AB0404 | via Fisher Scientific |
| ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) | Molecular BioProducts, Inc. | Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) | via Sigma-Aldrich |
| Pipettes (P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | via Gilson |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| MasterPure DNA Purification Kit | Epicentre | MCD85201 | via Epicentre Technologies Corp |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Scientific | SM1333 | via ThermoFisher |
| RediLoad Loading Buffer | Invitrogen | 750026 | via ThermoFisher |
| Chemicals | |||
| Chemicals for Library and Individual Mutant Storage | |||
| Glycerol MB Grade, 1L | Sigma Aldrich | G5516 | via Sigma-Aldrich |
| LB Broth | Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, 1994.) | ||
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | via Sigma-Aldrich |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | via Sigma-Aldrich |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | via Sigma-Aldrich |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S8045 | via Sigma-Aldrich |
| LB agar | See preparation above, add 15g Bacto Agar | ||
| Bacto Agar | Sigma Aldrich | A5306 | via Sigma-Aldrich |
| Gentamicin sulfate, 10g | BioReagent | 1405-41-0 | via Sigma-Aldrich |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815024 | via ThermoFisher |
| Ethanol, 190 proof | Decon | 04-355-221 | via Fisher Scientific |
| Chemicals for Quality Control PCR | |||
| Primers | User-preferred vendor | See primers listed in Table 3 | |
| Corning cellgro Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | via Fisher Scientific |
| Taq Polymerase Buffer | Invitrogen | 10342020 | via ThermoFisher |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342020 | via ThermoFisher |
| dNTPs | Invitrogen | 10297018 | via ThermoFisher |
| Agarose | Sigma | A9539 | via Sigma-Aldrich |
Riferimenti
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
- Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
- Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
- Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
- Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
- Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
- Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
- Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
- Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
- . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016)
- Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
- National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
- Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. . Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
- Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
- Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
- Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
- Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
- Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
- Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
- Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
- He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
- Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
- Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
- Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
- Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
- Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
- Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
- Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
- Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
- Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
- Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
- Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
- Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
- Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
- Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
- van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
- Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
- . . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
- Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
- Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
- Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).
