Replica di ordinato, Nonredundant biblioteca del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PA14 trasposone inserimento mutanti

Eliana Drenkard; Rhianna M. Hibbler; D. Alina Gutu; Alexander D. Eaton; Amy L. Silverio; Frederick M. Ausubel; Bryan P. Hurley; Lael M. Yonker

doi:10.3791/57298

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Articolo metodologico

Replica di ordinato, Nonredundant biblioteca del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PA14 trasposone inserimento mutanti

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DOI:

10.3791/57298

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4 maggio 2018

Eliana Drenkard^*¹ , Rhianna M. Hibbler^*¹ , D. Alina Gutu² , Alexander D. Eaton¹ , Amy L. Silverio¹ , Frederick M. Ausubel²^,³ , Bryan P. Hurley¹^,⁴ , Lael M. Yonker¹^,⁴

¹Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, ²Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, ³Department of Genetics, Harvard Medical School, ⁴Department of Pediatrics, Harvard Medical School

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'infezione di Pseudomonas aeruginosa causa la morbosità significativa in host vulnerabili. La biblioteca di mutante di inserimento trasposone nonredundant di p. aeruginosa ceppo PA14, designato come PA14NR insieme, facilita l'analisi della funzionalità del gene in numerosi processi. Presentato qui è un protocollo per generare copie di alta qualità della libreria mutante PA14NR impostare.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa è un batterio gram-negativo fenotipicamente e geneticamente vario e adattabile onnipresente in ambienti umani. P. aeruginosa è in grado di formare biofilm, sviluppano resistenza agli Antibiotico, produrre fattori di virulenza ed evolversi rapidamente nel corso di un'infezione cronica. Così p. aeruginosa può causare sia acuta e cronica, difficile da trattare infezioni, con conseguente morbosità significativa in alcune popolazioni di pazienti. Ceppo di p. aeruginosa PA14 è un isolato clinico umano con una struttura di genoma conservato che infetta una varietà di mammiferi e nonvertebrate padroni di casa rendendo PA14 un ceppo attraente per lo studio di questo agente patogeno. Nel 2006, è stata generata una libreria di mutante inserimento nonredundant trasposone contenente 5.459 mutanti corrispondente a 4.596 geni PA14 predetti. Da allora, la distribuzione della libreria PA14 ha permesso alla comunità di ricerca comprendere meglio la funzione dei singoli geni e vie complesse di p. aeruginosa. Mantenimento dell'integrità della biblioteca attraverso il processo di replica richiede tecniche di corretta gestione e precise. A tal fine, questo manoscritto presenta protocolli che descrivono in dettaglio i passaggi coinvolti nella replica di biblioteca, libreria di controllo di qualità e una corretta conservazione dei singoli mutanti.

Introduzione

Pseudomonas aeruginosa è un batterio gram-negativo fenotipicamente e geneticamente vario e adattabile presente nel suolo, acqua e ambienti più umani, come pure della pelle microflora. Rispetto a molte specie batteriche, p. aeruginosa ha un genoma relativamente grande di 5.5-7 Mbp con alto contenuto G + C (65-67%). Inoltre, una percentuale significativa dei suoi geni sono coinvolta nella capacità di adattamento metabolico e fanno parte di reti di regolazione, consentendo una grande flessibilità in risposta a stress ambientali¹. P. aeruginosa esprime una miriade di fattori di virulenza, esibisce la propensione a forma d....