ظهرت مفصص الجزئي: نموذج جراحية لتجديد الكبد مورفولوجك
Summary
نقدم هنا، طريقة جديدة لاستئصال جزئي للفص الكبدي الأيسر في الفئران حديثي الولادة (يوم 0). هذا البروتوكول الجديد مناسبة لدراسة إصابة الكبد الحاد والإصابة وردا في إعداد المواليد.
Abstract
تجديد الجهاز المورفولوجية عقب فقدان الأنسجة الحادة شيوعاً بين الفقاريات أقل، ولكن نادراً ما يلاحظ في الحياة بعد الولادة الثدييات. تجديد الكبد الكبار بعد 70% الجزئية ظهرت النتائج في تضخم تتمثل مع بعض النسخ المتماثل في الفصوص المتبقية مع استعادة النشاط الأيضي، ولكن مع خسارة دائمة للفص المصاب في مورفولوجيا والهندسة المعمارية. هنا، نحن بالتفصيل أسلوب جراحية جديدة في الوليد أن يترك بيئة الفسيولوجية المؤدية إلى التجديد. هذا النموذج يتضمن بتر ابيكس الفص الأيسر ونظام إدارة محافظ لاحقة، ويفتقر إلى ضرورة ربط السفن الكبد الرئيسية أو الإصابة الكيميائية، ترك بيئة الفسيولوجية التي قد تحدث فيها تجديد. أننا نقدم هذا البروتوكول إلى بتر الأطراف في الأحداث (P7-14) الفئران، خلالها التحولات الكبد المتضرر من تجديد الجهاز إلى النمو التعويضي بتضخم. ينص البروتوكول على 30 دقيقة قصيرة وقدم إطارا لدراسة آليات التجديد وتدنيها المرتبطة بالعمر في الثدييات، ووصف الجذعية الكبدية المفترضة أو فروعه.
Introduction
القدرة على إعادة تكوين جهاز، أو لاستعادة الشكل والوظيفة، وقد كان من المعتقد أن يضيع معظمها على مر الزمن التطوري. تم العثور على إمكانات التجدد في الكبد الثدييات الكبار بعد الإصابة الحادة الكيميائية أو الفيزيائية تشمل تعبئة جميع خلايا الكبد المتبقية مما أدى إلى موجات تضخم وجولات قليلة من انقسام الخلية، نتج عنه ولكن الوظيفية الجهاز معماريا مختلفة1،2،3،،من45. في الآونة الأخيرة، بدأت الدراسات لوصف استجابة أجهزة الثدييات الولدان التجديدي للإصابة خلال الأسبوع الأول من الحياة6،،من78. وقد أظهرت هذه الدراسات أن عندما أصيب بجروح أثناء تنمية الأطفال حديثي الولادة، تستجيب بعض أجهزة الثدييات مع التجدد المورفولوجية بدلاً من7،النمو أو التليف التعويضي8.
وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن تجديد البنية العالمية والدالة يحدث خلال أوائل الفترة الوليدية6،7،8. تتضمن البروتوكولات المتبعة إصابة الكبد الإصابة الكيميائية أو إدارة الإيثانول9،،من1011، أسيتامينوفين12،،من1314،15 ، رابع كلوريد الكربون16،17،،من1819، 70% ظهرت الجزئية4،،من2021، أو إزالة لليسار و الفصوص الوسيط. يؤدي إلى موت الخلية تتمثل إدارة المواد الكيميائية، ولكن كثيرا ما يترك هياكل الجزئي والكلى سليمة. تجديد مورفولوجك لا سهولة دراستها في هذا السياق، كما كان عدم طمس بنية الكبد عموما. ظهرت الجزئي 70% ينطوي على ربط خياطة الأوعية الرئيسية، هو أمر ضروري لوقف النزيف، ولكنه يترك بيئة غير الفسيولوجية بالانقطاع الدائم للمفرج. وعلاوة على ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب فقط على القوارض الكبار، وتطبيقه لحديثي الولادة من الناحية التقنية صعبة للغاية. مع هذا في الاعتبار، قمنا بتطوير أسلوب الذي يتم إزالة 20-30 في المائة ذروة الفص الأيسر في ماوس P0 حديثي الولادة (الشكل 1A-1B). هذا الأسلوب هو المحافظ جراحيا، مينيملي، لا من الناحية التقنية الصعبة، ويؤدي إلى إجمالي الخسارة مورفولوجيا دون الربط للمفرج، مما يترك مجالاً للتجديد بحيث تحدث. يسمح البروتوكول خطوة بخطوة الناتجة، المبينة أدناه، لأي باحث لأداء ظهرت مفصص جزئي على الفئران حديثي الولادة من أجل دراسة الثدييات التجدد الولدان في المراحل الأولى من الحياة بعد الولادة. هذا الأسلوب أيضا بتطبيقات واضحة للدراسات المقارنة في الطب التجديدي، وبيولوجيا الخلايا الجذعية، كما يمكن استخدامه في الكبد خلال المراحل اللاحقة من الحياة.
الدراسات إصابة الكبد الحاد الأكثر شيوعاً هي الأضرار التي يسببها كيميائيا أو بتر الكبد الكبار، أو ظهرت الجزئي 70%. الأضرار الكيميائية غالباً ما ينطوي على الإدارة عن طريق الحقن الوريدي أو داخل الفم من الاسيتامينوفين، ورابع كلوريد الكربون، أو الإيثانول، وهو نموذج إصابة سهلة نسبيا وغير الغازية. كما نوقش سابقا، نتائج الأضرار الكيميائية في موت الخلية تتمثل، ولكن كثيرا ما يترك سدى ولحمة هياكل سليمة، مما يجعل من الصعب تقديم ادعاءات حول تجديد السمات. الأضرار الكيميائية غالباً ما تدور حول الأوعية الكبدية، مما يجعل من تقنية مفيدة لدراسة الموقع وإصابة خلية على حدة، ولكن أيضا يجعل من الصعب على استجواب، على مستوى الجهاز كله، السكان الأخرى التي قد يقع أبعد عن السفن، والتي قد المساهمة في التجديد. وعلى الرغم من هذه القيود، الأضرار الكيميائية لا يزال نموذج إصابة مفيدة وهامة جداً من الناحية الفسيولوجية.
الكبار 70% الجزئية ظهرت ينطوي على إزالة الفصوص اليمين والوسط بعد عملية ربط المفرج الكبد. اتسمت الاستجابة لظهرت أيضا: الكبد المبتورة 14 يوما وظيفة جزئية 70% ظهرت يطور بنية مختلفة صارخ عن الفص غير التالفة الأصلي، كخلايا الكبد الفصوص الحق وكودات المتبقية الخضوع لتضخم وبضع جولات من انقسام الخلية4،5. هذا يجعل الكتلة المفقودة ووظيفة، ولكن فشل لتجديد الفصوص المبتورة اثنين، ولذلك لا يحل محل مورفولوجيا الإجمالي. نتيجة لذلك الاستجابة الإصابة إلى 70% ظهرت جزئية مفيدة لدراسة آليات النمو التعويضي مع التجديد محدودة.
هنا، نحن تماما وصف بروتوكول لظهرت مفصص جزئي الأطفال حديثي الولادة. ويشمل الإجراء اختيار الحيوان المناسب والتحضير وإعداد الحقل الجراحي والجراحة والانتعاش. التحسين والتكيف لكل خطوة من هذه الخطوات قد تكون مطلوبة من أجل تطبيقات مختلفة للبروتوكول.
لدينا يقوم على نطاق واسع والأمثل هذا البروتوكول في البرية نوع C57BL/6J الجراء (جاكس 000664)، ومع ذلك، لدراسة آليات التجدد والسكان خلية مختلفة، كنا أيضا مختلف الحيوانات المحورة وراثيا بما في ذلك الفئران التي تأوي العرقية المختلفة و CreERT2 المتسلسلات و/أو تدق الوظائف الإضافية (جاكسAxin2CreERT2 018867، وجاكس Sox9CreERT2 018829) في تركيبة مع الصحفيين الفلورية، مثل نظم قوس قزح ومتمج (R26VT2/GK3، R26 mT/mG) 22 , 23-وجدنا لا حاجة لتغيير هذه المنهجية لسلالات مختلفة من الماوس، كما لم يلاحظ أي اختلاف في نتائج البقاء على قيد الحياة أو إمكانات التجدد.
بالإضافة إلى استخدام سلالات حيوانية مختلفة، أجرينا أيضا هيباتيكتوميس مفصص الجزئي على الفئران حديثي الولادة تعامل مع جزيئات صغيرة، مثل 4-هيدروكسي-تاموكسيفين و 5-اثينيل-2 ‘–ديوكسيوريديني (إيدو). الإيثانول وثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) استخدمت كمذيبات، حيث تبين أن زيت الذرة كان سببا مهما للإصابة بالأمراض. وإلا وجدنا أن الإدارة داخل جزيئات صغيرة لا تؤثر على نتائج التجدد أو البقاء على قيد الحياة. ونتنبأ بأن هذا البروتوكول سيتم تكييف للاستخدام مع جزيئات أخرى صغيرة استجواب مختلف جوانب التجديد.
يمكن أن يكون تحديا من الناحية التقنية والعمليات الجراحية الماوس الولدان وقد تتطلب خبرة خاصة في التعامل مع الحيوانات والتشريح المجهري. خبرة تربية الحيوان ضروري لتجنب الأم أكل لحوم البشر بعد الجراحة، وخلال فترة الانتعاش الفوري.
Protocol
Representative Results
Discussion
إصابة الكبد الحاد تقليديا ودرست استخدام المادة الكيميائية (أسيتامينوفين، الإيثانول، ورابع كلوريد الكربون)، أو نماذج الجراحية (70% ظهرت الجزئي). قد اتسم رد التجدد بعد 70% ظهرت جزئية إشراك تضخم تتمثل العالمية وجولات متعددة من انقسام الخلية4،5. لوقف النزف، هذا ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر شو ص لأداء ح & ه وعلم الأنسجة؛ وجيم وانغ ومكارتي أ لإجراء مناقشات مفيدة. وكان دعم الأبحاث من خلال تمويل من فرجينيا ودال ك لودفيغ صندوق “أبحاث السرطان”؛ الوطنية القلب والرئة، والدم معهد (R01HL058770 و U01HL099999)؛ وأيد البشرية الحدود العلوم البرنامج الوظيفي التنمية جائزة (CDA00017)، مؤسسة البحوث الألمانية (ري 2787/1)، ومعهد الخلايا الجذعية سيبيل، معهد كاليفورنيا “الطب التجديدي” (RC1 00354) المنح إلى I.W. Y.R. مؤسسة سيبل ستايسي (1119368-104-غبجي) وتوماس. J.M.T. أيده المعاهد الوطنية للصحة (T32GM007365)، وجائزة دائرة البحوث الوطنية (1F30DK108561)، وبول والزمالة سوروس ديزي “الأميركيين جديد”.
Materials
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
Riferimenti
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a. Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a., Dolak, J. a., Waller, R. L. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
