Summary

आंशिक Lobular Hepatectomy: सुघड़ जिगर पुनर्जनन के लिए एक शल्य मॉडल

Published: May 31, 2018
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Summary

यहां, हम नवजात (0 दिन) चूहों में छोड़ दिया यकृत पालि के आंशिक लकीर के लिए एक नई विधि प्रस्तुत करते हैं । इस नए प्रोटोकॉल नवजात की स्थापना में तीव्र जिगर की चोट और चोट प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

रूपात्मक अंग पुनर्जनन निंनलिखित तीव्र ऊतक हानि कम रीढ़ के बीच आम है, लेकिन शायद ही कभी स्तनधारी जन्मोत्तर जीवन में मनाया जाता है । ७०% आंशिक hepatectomy परिणाम के बाद वयस्क जिगर पुनर्जनन चयापचय गतिविधि की बहाली के साथ शेष पालियों में कुछ प्रतिकृति के साथ hepatocyte अतिवृद्धि में, लेकिन घायल पालि आकृति विज्ञान और वास्तुकला के स्थाई नुकसान के साथ । यहां, हम विस्तार neonate में एक नई शल्य चिकित्सा पद्धति है कि एक शारीरिक उत्थान के लिए अनुकूल वातावरण छोड़ देता है । इस मॉडल को छोड़ दिया पालि सर्वोच्च और बाद में रूढ़िवादी प्रबंधन आहार के विच्छेदन शामिल है, और प्रमुख जिगर वाहिकाओं या रासायनिक चोट के बंधाव के लिए आवश्यकता का अभाव है, एक शारीरिक वातावरण जहां पुनर्जनन हो सकता है छोड़ने । हम किशोर पर विच्छेदन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार (P7-14) चूहों, जिसके दौरान अंग पुनर्जनन से घायल जिगर संक्रमण अतिवृद्धि द्वारा क्षतिपूरक विकास के लिए. प्रस्तुत, संक्षिप्त 30 मिनट प्रोटोकॉल एक रूपरेखा के उत्थान के तंत्र का अध्ययन प्रदान करता है, अपनी उंर स्तनधारियों में गिरावट से जुड़े, और ख्यात यकृत स्टेम या progenitors के लक्षण वर्णन ।

Introduction

करने के लिए एक अंग पुनर्जंम, या फार्म और समारोह बहाल करने की क्षमता, ज्यादातर विकासवादी समय पर खो सोचा गया है । तीव्र रासायनिक या शारीरिक चोट के बाद वयस्क स्तनधारी जिगर की अपक्षयी क्षमता अतिवृद्धि की लहरों और कोशिका विभाजन के कुछ दौर में जिसके परिणामस्वरूप शेष सभी हेपैटोसाइट्स के जुड़ाव को शामिल करने के लिए पाया गया है, एक कार्यात्मक लेकिन वास्तु अलग अंग1,2,3,4,5. हाल ही में, अध्ययनों से नवजात स्तनधारी अंगों के जीवन के पहले सप्ताह के भीतर चोट करने के लिए6,7,8के अपक्षयी प्रतिक्रिया विशेषताएं शुरू कर दिया है । इन अध्ययनों से पता चला है कि जब नवजात विकास के दौरान घायल, कुछ स्तनधारी अंगों रूपात्मक पुनर्जनन के बजाय क्षतिपूरक वृद्धि या फाइब्रोसिस7,8के साथ प्रतिक्रिया ।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि दोनों वैश्विक संरचना और समारोह के पुनर्जनन जल्दी नवजात अवधि6,7,8के दौरान होता है । जिगर की चोट प्रोटोकॉल की स्थापना की रासायनिक चोट या इथेनॉल9,10,11, एसिटामिनोफेन12,13,14,15 के प्रशासन शामिल , कार्बन टेट्राक्लोराइड16,17,18,19, ७०% आंशिक hepatectomy4,20,21, या बाएं से हटाने और माध्य पालि । रासायनिक प्रशासन hepatocyte कोशिका मृत्यु की ओर जाता है, लेकिन अक्सर सूक्ष्म और स्थूल संरचनाओं बरकरार छोड़ देता है । सुघड़ पुनर्जनन आसानी से इस संदर्भ में अध्ययन नहीं किया जा सकता है, के रूप में समग्र यकृत वास्तुकला obliterated नहीं था । ७०% आंशिक hepatectomy प्रमुख जहाजों की सीवन बंधाव शामिल है, जो रक्तस्राव को रोकने के लिए आवश्यक है, लेकिन vasculature के स्थायी विघटन के साथ एक गैर-शारीरिक वातावरण छोड़ देता है । इसके अलावा, इस विधि केवल वयस्क कुतर पर इस्तेमाल किया गया है, और नवजात शिशुओं के लिए अपने आवेदन तकनीकी रूप से बेहद मुश्किल है । इस के साथ मन में, हम एक विधि है जिसमें बाएं पालि के शीर्ष के 20-30% एक नवजात P0 माउस (चित्र 1a-1b) में हटा दिया है विकसित की है । इस विधि शल्य चिकित्सा रूढ़िवादी है, न्यूनतम इनवेसिव, नहीं तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और vasculature के बंधाव बिना आकृति विज्ञान के सकल नुकसान की ओर जाता है, होने के लिए पुनर्जनन के लिए कमरे में जा. परिणामस्वरूप कदम दर कदम प्रोटोकॉल, नीचे वर्णित है, किसी भी शोधकर्ता के लिए नवजात चूहों पर एक आंशिक lobular hepatectomy प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है ताकि प्रसव के बाद के जीवन के प्रारंभिक दौर में स्तनधारी नवजात उत्थान के अध्ययन के लिए । इस विधि भी पुनर्अपक्षयी चिकित्सा और स्टेम सेल जीवविज्ञान में तुलनात्मक अध्ययन करने के लिए स्पष्ट आवेदन किया है, क्योंकि यह जीवन के बाद के चरणों के दौरान जिगर में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

सबसे आम तीव्र जिगर की चोट के अध्ययन रासायनिक-प्रेरित नुकसान कर रहे हैं, वयस्क जिगर विच्छेदन, या ७०% आंशिक hepatectomy. रासायनिक नुकसान अक्सर नसों, intraperitoneal या एसिटामिनोफेन, कार्बन टेट्राक्लोराइड, या इथेनॉल के मौखिक प्रशासन शामिल है, और एक अपेक्षाकृत आसान और गैर इनवेसिव चोट मॉडल है । के रूप में पहले से चर्चा की, hepatocyte कोशिका मृत्यु में रासायनिक नुकसान परिणाम है, लेकिन अक्सर स्ट्रोमा और पैरेन्काइमा संरचनाओं बरकरार छोड़ देता है, यह मुश्किल सुघड़ पुनर्जनन के बारे में दावा करने के लिए बना । रासायनिक नुकसान अक्सर यकृत वाहिकाओं पर केंद्र, यह एक उपयोगी तकनीक साइट और सेल विशेष चोट का अध्ययन करने के लिए बना रही है, लेकिन यह भी मुश्किल से पूछताछ करने के लिए बनाता है, पूरे अंग स्तर पर, अन्य आबादी है कि आगे जहाजों से स्थित हो सकता है और कि हो सकता है उत्थान में योगदान करें । इन सीमाओं के बावजूद, रासायनिक नुकसान अभी भी एक उपयोगी और उच्च शारीरिक रूप से प्रासंगिक चोट मॉडल रहता है ।

वयस्क ७०% आंशिक hepatectomy यकृत vasculature के बंधाव निंनलिखित छोड़ दिया और औसत पालियों को हटाने शामिल है । hepatectomy की प्रतिक्रिया अच्छी तरह से किया गया है: विच्छेदित जिगर 14 दिनों के बाद ७०% आंशिक hepatectomy कि मूल क्षति पालि के से एक निहायत अलग वास्तुकला विकसित करता है, शेष सही और caudate पालियों के हेपैटोसाइट्स के रूप में अतिवृद्धि और सेल डिवीजन4,5के कुछ दौर से गुजरना । इस बनाता है बड़े पैमाने पर खो दिया है और समारोह, लेकिन दो काट पालियों पुनर्जीवित करने में विफल रहता है, और इसलिए सकल आकृति विज्ञान की जगह नहीं है । नतीजतन, ७०% आंशिक hepatectomy के लिए चोट प्रतिक्रिया सीमित पुनर्जनन के साथ क्षतिपूरक विकास तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है ।

यहां, हम पूरी तरह से एक नवजात आंशिक lobular hepatectomy के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । प्रक्रिया उचित पशु चयन और तैयारी, शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयारी, शल्य चिकित्सा, और वसूली शामिल है । अनुकूलन और इन चरणों में से प्रत्येक के अनुकूलन प्रोटोकॉल के विभिंन अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है ।

हम बड़े पैमाने पर प्रदर्शन किया है और इस प्रोटोकॉल अनुकूलित वंय प्रकार C57BL/6J पिल्ले (JAX ०००६६४) पर, तथापि, विभिंन कोशिका आबादी और उत्थान के तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हम भी विभिंन Cre बंदरगाह चूहों सहित विभिंन ट्रांसजेनिक जानवरों का इस्तेमाल किया और CreERT2 transgenes और/या दस्तक-ins (Axin2CreERT2 JAX ०१८८६७, और Sox9CreERT2 JAX ०१८८२९) फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ संयोजन में, जैसे इंद्रधनुष और mTmG सिस्टंस (R26VT2/GK3, R26 एमटी/मिलीग्राम) 22 , 23. हम अलग माउस उपभेदों के लिए इस पद्धति को बदलने की जरूरत नहीं पाया, अस्तित्व के परिणामों या अपक्षयी क्षमता में कोई मतभेद के रूप में मनाया गया ।

विभिन्न पशु उपभेदों का उपयोग करने के अलावा, हम भी 4-hydroxy-tamoxifen और 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) के रूप में छोटे अणुओं, के साथ इलाज नवजात चूहों पर आंशिक lobular hepatectomies प्रदर्शन किया. Dimethyl sulfoxide (DMSO) और इथेनॉल सॉल्वैंट्स के रूप में इस्तेमाल किया गया, के रूप में यह पाया गया कि मकई तेल रुग्णता का एक महत्वपूर्ण कारण था । हम अंयथा पाया है कि छोटे अणुओं के intraperitoneal प्रशासन अस्तित्व या अपक्षयी परिणामों को प्रभावित नहीं किया । हम भविष्यवाणी है कि इस प्रोटोकॉल अंय छोटे अणुओं के साथ उपयोग के लिए पुनर्जनन के विभिंन पहलुओं से पूछताछ के लिए अनुकूलित किया जाएगा ।

नवजात माउस सर्जरी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और पशु हैंडलिंग और सूक्ष्म विच्छेदन में विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता हो सकती है । पशुपालन विशेषज्ञता के लिए सर्जरी के बाद मातृ और तत्काल वसूली की अवधि के दौरान नरभक्षी से बचने के लिए आवश्यक है ।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों प्रयोगशाला पशु देखभाल इंटरनेशनल (AAALAC) और प्रयोगशाला पशु पर स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के प्रशासनिक पैनल के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा उल्लिखित दिशा निर्देशों के सा…

Representative Results

चित्र 1a विवरण नवजात आंशिक lobular hepatectomy की एक सामांय समयरेखा ( चित्र 1bमें योजनाबद्ध), और समय की उंमीद की लंबाई के लिए पुनर्जनन जब तक इंतज़ार किया है मनाया । वाम पालि के सूक्ष्?…

Discussion

तीव्र यकृत चोट परंपरागत रूप से रासायनिक (एसिटामिनोफेन, इथेनॉल, कार्बन टेट्राक्लोराइड), या शल्य चिकित्सा मॉडल (७०% आंशिक hepatectomy) का उपयोग कर अध्ययन किया गया है । ७०% आंशिक hepatectomy के बाद reअपक्षय प्रतिक्रिया वैश?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम एच एंड ई और प्रोटोकॉल प्रदर्शन के लिए पी चू धंयवाद; और सी. वांग और ए. McCarty के लिए उपयोगी विचार-विमर्श । अनुसंधान वर्जीनिया और डी. के. लुडविग कोष से कैंसर अनुसंधान के लिए धन के माध्यम से समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01HL058770 और U01HL099999); और कैलिफोर्निया संस्थान के लिए reअपक्षय चिकित्सा (RC1 ००३५४) I.W. Y.R. को अनुदान मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम कैरियर विकास पुरस्कार (CDA00017), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (आरआई 2787/1), Siebel स्टेम सेल संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था, और थॉमस और स्टेसी Siebel फाउंडेशन (1119368-104-GHBJI) । J.M.T. NIH (T32GM007365), राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार (1F30DK108561), और नए अमेरिकियों के लिए पौलुस और डेज़ी सोरोस फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Animals
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
Name Company Catalog Number Comments
Standard Reagents
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Dissecting microscope Zeiss ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors Vannas 72932-01
5SF Forceps Dumont 11252-00
Straight Kelly forceps Grainger 17-050G
Heating pad Sunbeam 000771-810-000
Isoflurane Abbott Labs 0044-5260-05
Rodent Anesthesia System Kent Scientific 1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm Fisher Scientific 13-761-52
Name Company Catalog Number Comments
Standard Equipment
1.5ml microcentrifuge tube Eppendorf 22363204
6-0 monocryl sutures Ethicon MCP489G
Petri dish Fisher Scientific  S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V Drummond 4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances Fisher Scientific 01-912-402
Low Cost Induction Chamber Kent Scientific SOMNO-0730

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Citazione di questo articolo
Tsai, J. M., Weissman, I. L., Rinkevich, Y. Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration. J. Vis. Exp. (135), e57302, doi:10.3791/57302 (2018).

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