Протокол для острой и хронической экотоксичности тестирования бирюза Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri
Summary
В этой работе мы описываем острых, хронических и поколениями биопроб для изучения воздействия одного и комбинированной стресс на бирюзовый Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri. Этот протокол предназначен для изучения истории жизни черты (смертности, рост, плодовитость, вес) и критических тепловой максимальный.
Abstract
Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri является формирующейся модели организма в области экотоксикологии и продемонстрировал его применимость в острых и хронических экотоксичности тестирования. В целом чувствительность видов токсичных соединений находится в диапазоне с, или выше, чем у других видов модели.
Эта работа описывает протоколы для острых, хронических и поколениями bioassays стрессор одного и комбинированных эффектов на N. furzeri. Благодаря своей короткой созревания время и жизненный цикл эта позвоночных модель позволяет исследования конечных точек, таких как время созревания и плодовитость в течение четырех месяцев. Следующих полного жизненного цикла испытания воздействия могут быть выполнены в качестве лишь 8 месяцев. Поскольку этот вид производит яйца, которые засухоустойчивых и остаются жизнеспособными в течение лет, на месте культуры видов не нужна, но люди могут быть набраны при необходимости. Протоколы предназначены для измерения жизни история черты (смертности, рост, плодовитость, вес) и критических тепловой максимальный.
Introduction
Чувствительность профили массива видов в стратегически выбранных токсикантов были описаны1 для европейских достичь законодательства (регистрации, оценки, авторизации и ограничении химических веществ). Острый или краткосрочной токсичности тесты главным образом использовались для этой цели, как они дают краткое указание видов чувствительности. Однако в их естественной среде, организмы подвергаются более длительных периодов и полного жизненного цикла или даже несколько поколений может быть пострадавших2. Кроме того в загрязненной среде организмов обычно подвергаются более чем одного стрессор в то время, которые могут взаимодействовать друг с другом, может привести к синергических эффектов3. Следовательно тесты на токсичность вычисляемые на основе острой, единый стрессор безопасной концентрации могут недооценивать фактические риски, введенных токсикантов в естественных условиях. Это, таким образом, целесообразно также изучить хронических и застроек эффекты сублетальные концентрации токсикантов в контексте экологически значимых как пропагандируемые Европейской Комиссии4,5 и АООС США (Соединенные Агентство по охране окружающей среды государств)6,7. Особенно в позвоночных исследований затрат труда, деньги и время являются высокими, при выполнении исследований хронической и застроек воздействия из-за относительно продолжительный позвоночных, по сравнению с моделью беспозвоночных организмов. Таким образом желательно выбрать наиболее подходящие модельный организм рыбы, в зависимости от исследования вопрос. Кроме того широкий спектр видов позвоночных должны быть доступны для того чтобы испытать общность ответов различных видов, чтобы иметь возможность адаптировать правила, основанные на наиболее чувствительных видов. В настоящее время существует необходимость разработки новых, эффективных протоколов с видов позвоночных модель характеризуется короткого жизненного цикла, снизить затраты на выполнение хронических и застроек воздействия на позвоночных7,8.
Бирюзовый Пецилиевые рыбы Nothobranchius furzeri представляет собой интересную модель рыб для использования в таких долгосрочных экспериментов воздействия из-за своей короткой созревания время и жизненного цикла (поколение время меньше, чем 4 недели9). Это означает, что экологически соответствующие конечные точки как время созревания и плодовитости могут быть изучены в короткие сроки по сравнению с другими рыбы модели7. Кроме того эти рыбы производят засухе, спящие яйца, которые остаются жизнеспособными в течение нескольких лет при хранении в стандартных условиях, тем самым устраняя необходимость непрерывной культуры9. В экотоксикологических исследований это также подразумевает что повторяют, что рыбы могут все быть вылупившихся в тот же момент, результате время одновременности для всех животных, даже среди партий яиц производится в разное время. Мы советуем использовать лаборатории штамм ГРЗ для выполнения экспериментов экспозиции. Этот штамм выполняет также в лабораторных условиях, гомозиготных (за исключением половых хромосом) и геном является хорошо характеризуется10,11.
В экотоксикологических исследований важно выбрать соответствующий диапазон концентраций теста. Несколько дополнительных методов может использоваться для этой цели. Диапазон номинальной концентрации могут быть основаны на чувствительность смежных видов, таких как Nothobranchius guentheri12. Кроме того диапазон может быть основан на чувствительности моделей стандартных рыб, таких как данио рерио (Danio рерио)2 , которые имеют сопоставимые чувствительность для большинства ядовитых веществ (Филипп et al. (в обзоре)). В сочетании с обоими из этих вариантов диапазон поиска эксперимента должны проводиться для выбора диапазона Номинальная концентрация. Для острого тестирования, исследователи должны быть направлены для лечения концентрация с 100% смертности, промежуточные и 0% смертности после 24 часов воздействия токсикант. Для хронической тестирования, желательно для запуска диапазон поиска эксперимент на две недели, чтобы проверить, если личинок смертности в состоянии с самых высоких концентраций теста не превышает 10% за этот отчетный период.
Протокол может служить в качестве основы для выполнения острого и хронического воздействия загрязнителей, переносимых водой на N. furzeri, изучения потенциальных последствий стресса на индивидуальных и клеточном уровне. Он также может использоваться для выполнения исследований многолетних стрессор для размещения выше экологической значимости, смешивания различных токсичных соединений или изучая интерактивные эффекты между загрязнением и другие природные раздражители (например хищничества) или антропогенных стресс (например потепление вследствие изменения климата).
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа описывает новый биопроб, используя Nothobranchius furzeri, новые модели организма, для изучения личности и комбинированные долгосрочные последствия токсикантов и другие раздражители. Представлены протоколы были успешно применяется для измерения чувствительности видов ядовиты?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны группе сфере UAntwerpen и Департамента защиты культур Ugent для анализа проб воды. Была оказана поддержка в ходе этого проекта центр передового опыта ‘ Эко и социально Эволюционная динамика (PF/10/007) ку Лёвен научный фонд. AFG (11Q0516N) и ESJT (FWO-SB151323) финансировались как докторских и ТП (12F0716N) как после защиты докторской диссертации по FWO Фландрии (Fonds Wetenschappelijk институте).
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
Riferimenti
- European-Chemicals-Bureau. . TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d. . Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- . Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996)
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
