Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay
Summary
Dieses Protokoll stellt eine neuartige in-vitro- Perle assay, die mehr entsprechend modelliert den Prozess der in Vivo Angiogenese durch den Einbau von Perizyten sprießen. Diese Änderung ermöglicht die Wulst-Assay, treuer rekapitulieren die Zellkulturmodells zellulären Interaktionen zwischen Endothelzellen und Wandbild Zellen, die entscheidend für die Angiogenese.
Abstract
Angiogenese ist das Wachstum neuer Gefäße aus bereits bestehenden Gefäßsystem und ist ein wichtiger Bestandteil von vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Embryogenese und Entwicklung, Wundheilung, Tumorwachstum und Metastasierung, und Augen und Herz-Kreislauf-Krankheiten. Wirksam in-vitro- Modelle, die die Biologie der Angiogenese rekapitulieren sind erforderlich, entsprechend diesen Prozess zu studieren und Mechanismen der Regulierung, die letztlich ausgerichtet werden können für neue therapeutische Strategien zu identifizieren. Die Perle-Angiogenese-Assay, der mehrere Phasen der Endothelzellen sprießen rekapitulieren zuvor nachgewiesen in-vitro-. Eine Einschränkung des Assays besteht jedoch ein Mangel von Endothel-Funktion Wandbild Zell-Interaktionen, die Schlüssel für die molekulare und phänotypische Regulierung der Endothelzellen sind in Vivo. Das Protokoll hier stellt eine Methodik für die Einbeziehung der Fototapete Zellen in der Wulst-Angiogenese-Assay und zeigt eine enge Vereinigung von Endothelzellen und Perizyten während der Keimung in Vitro. Das Protokoll enthält auch eine Methode zur effektiven verstummen der Zielgene mit SiRNA in Endothelzellen für mechanistische Studien. Insgesamt bietet dieses Protokolls einen in-vitro- Test, der passender Modelle der verschiedenen Zelltypen sprießen Angiogenese beteiligt, und bietet eine physiologisch relevanten Plattform für therapeutische Beurteilung und neuartige Entdeckung Mechanismen der Angiogenese-Verordnung.
Introduction
Angiogenese ist wichtig, entsprechende Embryogenese und Wundheilung, und es spielt auch Schlüsselrollen bei zahlreichen Erkrankungen einschließlich Krebs Fortschreiten1 und koronare Krankheit. 2 , 3 ein besseres Verständnis der wie Angiogenese auftritt während der normalen Entwicklung, und wie es in pathologischen Situationen reaktiviert wird ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger, wirksame Therapeutika. Treu in-vitro- Modelle, die die wichtigsten Stationen und Zelltypen Angiogenesis in Vivo beteiligt rekapitulieren sind notwendig, um Forscher besser charakterisieren die molekularen Mechanismen, die Angiogenese zu fahren und neue Entdeckungen machen lassen in Endothelzellen Verordnung.
Nakatsu und Hughes haben eine sprießende Wulst-Assay optimiert, die sie gezeigt haben, die vielen bekannten Phasen der Angiogenese sprießen erfährt. 4 , 5 die hier vorgestellte Methode soll bauen auf den Test von Nakatsu und Hughes durch die Einbeziehung von Perictyes in der Probe, so optimiert, dass die parakrine und Juxtracrine Rollen der Fototapete Zellen in Endothelzellen sprießen einbezogen werden können neuartige Angiogenese Studien. Dadurch werden Fototapete Zellen, die durch ihre Rolle definiert sind, wie Zellen, die pflegen Körperkontakt mit Endothelzellen durch ihre Einbettung in die vaskuläre Basalmembran schließen. 6 Perizyten und Endothelzellen betreiben komplexe Übersprechen über Signalwege einschließlich Kerbe Signaltechnik, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ und viele andere. 7 , 8 -Maus-Modellen einen Mangel an diese Signalwege zeigen schlechte Pericyte Abdeckung Gefäßsystem in Embryogenese, führt zu schlechten Gefäße Umgestaltung und dysfunktionalen Gefäßsystem zu entwickeln. 7 darüber hinaus ist die Rolle der Perizyten im pathologischen Angiogenese wichtig, aber oft unterschätzt. Ein einzigartiges Merkmal des Tumors Gefäßsystem ist beispielsweise, dass die Schiffe unreif, undichte und dysfunktionalen aufgrund schlechter Pericyte Abdeckung sind. 9 es wurde vorgeschlagen, dass das Vorhandensein oder Fehlen von Perizyten dramatisch wirkt sich auf den Phänotyp von Tumor-Blutgefäßen und ein wichtiger Vermittler der Reaktionen auf Anti-angiogenetische und Antitumor-Therapien ist. 9 so ist Schlüssel zu mehr vollständige Erfassung der wichtigen Mechanismen der endothelialen Verordnung einschließlich der Rolle der Perizyten in in-vitro- Tests.
Zwar gibt es viele in-vitro- und Ex-Vivo Tests beschäftigt, Angiogenese zu studieren, gibt es Mängel in jedem betrachten. Einige, wie endotheliale Proliferation und endotheliale Migration Assays werden übermäßig vereinfacht und konzentrieren sich auf eine endotheliale Funktion in einer isolierten Umgebung auf Gewebekultur Kunststoff. 10 andere Assays treten in eine weitere 3 dimensionale (3D) Einstellung, wie Matrigel Rohr Bildung Assay,10 aber diese Tests immer noch stark vereinfacht sind und konzentrieren sich mehr auf die Fähigkeit der Endothelzellen zu migrieren und bilden de Novo vaskuläre Strukturen, im Gegensatz zu sprießen aus bereits bestehenden Gefäßsystem. Darüber hinaus enthalten keines dieser Assays Wandbild Zelltypen. Es gibt ex Vivo Modelle wie die Ring-Aorta-Assay, die Perizyten im Host-Orgel zu integrieren, zu tun, aber genetische Manipulation dieser Modelle ist viel schwieriger, wegen der Notwendigkeit der Generierung von Knockout oder transgenen Mausmodellen von der Wege von Interesse. Das Korn sprießen Assay ist ideal, weil es Endothelzellen sprießen, Proliferation, Migration und sogar Anastomose und Lumen Bildung in einer 3D Matrix Modelle. 4 der Assay erlaubt treu mechanistischen Bewertung von den vielen verschiedenen Phasen des sprießen, wobei noch für direkte genetische Modifikation von Endothelzellen oder Perizyten in einer mehr kontrollierten Umgebung. Das Fibrin gerinnt, enthält die sprießenden Perlen leicht fixiert, gefärbt, und abgebildet in verschiedenen Stadien der Keimung; Diese Sprossen können auch in einer live imaging Echtzeit-Bildgebung von Keimen führen platziert werden. Die hier vorgestellte Methodik ist ideal für das Studium der grundlegenden Mechanismen der Angiogenese durch in Tiefe Phänotypisierung und gründliche Analyse der Wege bei der Angiogenese aktiviert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Charakterisierung der komplexen Phasen und Zellkulturmodells zellulären Interaktionen von sprießen Angiogenese durch die Aktivierung des Forschers, genetische und bildgebende Methoden eingehende mechanistische Untersuchungen zu beschäftigen. Bei der Durchführung des Tests muss effizient endotheliale Beschichtung der Perlen während der Wulst Agitation Schritte stattfindet. Armen endotheliale Beschichtung erfolgt offensichtlich, wenn die Perlen nicht angezeigt werden, haben ein…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Victoria Bautch und Joshua Boucher für hilfreiche Gespräche und Beratung bei Optimierung standard Wulst sprießen Assay-Bedingungen und eine sprießende Assay Färbeprotokoll. S.H.A. wurde teilweise unterstützt durch einen Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Sciences unter 5T32 GM007092 zu vergeben.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
Riferimenti
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