שילוב Pericytes חרוז תא אנדותל הלבלוב Assay
Summary
מתנות פרוטוקול זה חרוז הרומן במבחנה assay זה יותר כראוי מודלים מתהליך ויוו הלבלוב אנגיוגנזה על-ידי שילוב pericytes. שינוי זה מאפשר וזמינותו חרוז רוצה להתרכז יותר בנאמנות באינטראקציה תאית heterotypic בין תאי אנדותל ותאים ציור קיר זה הם קריטיים עבור אנגיוגנזה.
Abstract
אנגיוגנזה הגידול של כלי חדש מ להערכת הקיימת מראש והוא מרכיב חשוב של תהליכים ביולוגיים רבים, כולל מופרה, ריפוי פצעים, הגידול ופיתוח גרורות, עינית ומחלות לב וכלי דם. יעיל במבחנה בדגמי לסכם את הביולוגיה של אנגיוגנזה יש צורך ללמוד את התהליך הזה ולזהות מנגנונים של רגולציה זה ניתן לפלח בסופו של דבר הרומן אסטרטגיות טיפוליות בהתאם. חרוז אנגיוגנזה וזמינותו הוכח בעבר כדי לסכם בשלבים רבים של לבלוב אנדותל במבחנה. אולם, מגבלה של זה וזמינותו היא מחסור של אנדותל – ציור קיר התא אינטראקציות, אשר הם המפתח ברגולציה פנוטיפי המולקולריים של תאי אנדותל לתפקד ויוו. פרוטוקול הנקובים להלן מציג מתודולוגיה שילוב של ציור קיר תאים לתוך חרוז אנגיוגנזה וזמינותו ומדגים קשר חזק של תאי אנדותל, pericytes במהלך נבטי חוץ גופית בתוך. הפרוטוקול מפרט גם במתודולוגיה לביצוע יעיל להחרשת גנים היעד באמצעות siRNA בתאי האנדותל ללימודי מכניסטית. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק assay במבחנה הולם יותר מודלים של סוגי תאים מגוונים מעורב הלבלוב אנגיוגנזה, והוא מספק פלטפורמה פיזיולוגית-רלוונטיים יותר טיפולית מגוונת גילוי הרומן מנגנוני רגולציה אנגיוגנזה.
Introduction
אנגיוגנזה חיוני מופרה המתאים, ריפוי פצעים, היא גם משחקת את תפקידי המפתח רבים מחלות כולל סרטן התקדמות1 ועורקים המחלה. 2 , 3 יש הבנה טובה יותר של כיצד אנגיוגנזה מתרחשת במהלך התפתחות רגילה, כיצד להפעילה בהקשרים פיפטות, הינה קריטית לפיתוח של הרומן, יעיל הרפוי. נאמן במבחנה בדגמי לסכם את השלבים החשובים ואת סוגי תאים מעורב אנגיוגנזה ויוו נדרשים כדי לאפשר לחוקרים כדאי לאפיין את המנגנונים המולקולריים נהיגה אנגיוגנזה, תגליות הרומן בתקנה אנדותל.
Nakatsu ו יוז יש אופטימיזציה של assay חרוז נבטי אשר הם הפגינו עובר בשלבים ידועים רבים של לבלוב אנגיוגנזה. 4 , 5 מטרת השיטה המובאת כאן היא לבנות וזמינותו אופטימיזציה על ידי Nakatsu ו יוז על ידי שילוב perictyes וזמינותו, כך ניתן לשלב את התפקידים paracrine ו- juxtracrine של ציור קיר תאי אנדותל תא הלבלוב ב מחקרים חדשניים אנגיוגנזה. Pericytes הם תאים ציור קיר המוגדרות על-ידי התפקיד שלהם התאים לשמור קרוב מגע פיזי עם תאי אנדותל עקב שלהם להיות מוטבע בתוך קרום המרתף כלי הדם. 6 Pericytes ותאי אנדותל לעסוק מורכבים צולבות לדבר באמצעות איתות המסלולים כולל חריץ איתות, אנג-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ, ועוד רבים אחרים. 7 , 8 דגמים העכבר בנכונותם איתות המסלולים האלה מדגימים pericyte המסכן כיסוי של פיתוח להערכת ב מופרה, שמוביל שיפוץ כלי הדם המסכן, להערכת תפקוד לקוי. 7 . בנוסף, התפקיד של pericytes ב אנגיוגנזה פיפטות הוא חשוב, אבל לעתים קרובות מוערכת. לדוגמה, תכונה ייחודית של הגידול להערכת היא כלי הם יותר ילדותי דולפים, לקוי בשל כיסוי עניים pericyte. 9 שהוא הוצע כי נוכחות או היעדרות של pericytes באופן משמעותי משפיע על פנוטיפ של גידול כלי דם והוא מתווך חשוב של תגובות אנטי-אנגיוגנטי וטיפולים antitumor. 9 . לפיכך, כולל התפקיד של pericytes ב במבחנה מבחני הוא מפתח ללכוד יותר לחלוטין על מנגנוני רגולציה אנדותל חשוב.
למרות שיש מבחני במבחנה , לשעבר vivo רבים מועסקים כיום ללמוד אנגיוגנזה, ישנם חסרונות לשקול בכל אחד מהם. כמה, כמו התפשטות אנדותל, מבחני ההעברה אנדותל, הופכות לפשוטות יותר מדי ולהתמקד על פונקציה אחת אנדותל באווירה מבודדת על תרביות רקמה פלסטיק. 10 מבחני אחרים מתרחשים בסביבה עוד 3 מימדי (3D), כגון Matrigel צינור היווצרות וזמינותו,10 אבל מבחני אלה הם עדיין oversimplified להתמקד יותר על היכולת של תאי אנדותל כדי להעביר ויוצרים דה נובו כלי דם מבנים, בניגוד מגיחה להערכת הקיימת מראש. יתר על כן, אף אחד אלה מבחני לשלב סוגי תאים ציור קיר. Ex-vivo מודלים כגון הטבעת אבי העורקים וזמינותו המשלבים pericytes נוכח האיבר המארח, אך מניפולציה גנטית של מודלים אלה הוא מאתגר יותר בשל הצורך של יצירת עכבר נוקאאוט או הטרנסגניים דגמי מסלולים מעניינים. החרוז הלבלוב assay אידיאלי כי זה מודלים הלבלוב אנדותל, הפצה, העברה ו אפילו השקה לומן היווצרות במטריצה תלת-ממד. 4 וזמינותו מאפשר בנאמנות להערכת מכניסטית בשלבים שונים רבים של לבלוב, תוך מתן אפשרות של שינוי גנטי ישיר של תאי אנדותל או pericytes באווירה מבוקרת יותר. קרישי פיברין המכיל את החרוזים נבטי יכול להיות בקלות קבוע, צבעונית, עם תמונה בשלבים שונים של לבלוב; נבטים אלה גם להנחה בתוך תא הדמיה חיה כדי לבצע הדמיה בזמן אמת של לבלוב. המתודולוגיה המוצגת כאן הינו אידיאלי עבור לימוד מנגנונים בסיסיים של אנגיוגנזה דרך ב phenotyping עומק וניתוח מעמיק של המסלולים מופעלים במהלך אנגיוגנזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטה אפיון שלבי מורכבים ואינטראקציות הסלולר heterotypic של לבלוב אנגיוגנזה על-ידי הפיכת החוקר להעסיק גישות גנטיות הדמיה לקיים חקירות יסודיות מכניסטית. בעת ביצוע וזמינותו, זה חיוני כי ציפוי אנדותל יעיל של החרוזים מתרחש בתקופת החרוז עצבנות צעדים. מסכן ציפוי אנדותל ייעשה ניכר, א?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד”ר ויקטוריה Bautch, ג’ושוע בושה על דיונים מועילים, עצות על אופטימיזציה חרוז סטנדרטי הלבלוב assay והתנאים של assay נבטי מכתים פרוטוקול. S.H.A. נתמך בחלקו על ידי מענק של הלאומית המכון כללי רפואי למדעים תחת פרס 5T32 GM007092.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
Riferimenti
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
