ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む
Summary
新規体外ビーズ アッセイをこのプロトコルより適切に体内の血管を組み込むことによって血管新生を萌芽の過程をモデル化します。この変更により、血管内皮細胞と血管新生に重要な壁画と有性の細胞間相互作用をより忠実に再現するビーズ アッセイ。
Abstract
血管新生は既存の血管から新しい血管の成長を胚形成と開発、創傷治癒、腫瘍の成長と転移を含む多くの生物的プロセスと眼と心血管疾患の重要なコンポーネントです。要約血管新生学効果の in vitroモデルは、適切にこのプロセスを研究し、新しい治療戦略のための最終的にターゲットすることができます調節機構が必要です。ビーズ血管新生アッセイは、以前内皮発芽の複数の段階を要約する実証されている体外。しかし、この試金の制限が無い体内の血管内皮-キーを内皮細胞の分子と表現の規制である壁画細胞の相互作用,機能します。ここに与えられたプロトコル ビーズ血管新生アッセイに壁細胞の混入のための方法論を提示し、発芽の培養中に血管内皮細胞と血管の緊密な関連を示します。プロトコルでは、効果的なサイレンシング機構研究の内皮細胞で siRNA を用いた遺伝子のための方法論についても詳しく説明します。完全に、このプロトコルは提供の in vitroアッセイをより適切に発芽して、血管新生に関与するさまざまな細胞タイプをモデル化し、治療評価の新規発見より生理学的関連性の高いプラットフォームを提供します血管新生の調節機構。
Introduction
血管新生は適切な胚形成、創傷治癒に不可欠ながん進行1冠動脈疾患を含む多くの疾患で重要な役割を果たします。2,3は、小説、効果的な治療法の開発のために重要な血管新生がどのように通常の開発時に発生して、それは病理学的コンテキストの再アクティブ化方法のより良い理解を持っていることです。良い運転して血管新生の分子機構を特徴と新しい発見をする研究者を許可する重要な段階と生体内の血管新生に関与する細胞の種類を再現忠実の in vitroモデルが必要内皮の規則。
中津とヒューズは、血管新生を発芽の多くの知られていた段階を経るを示している発芽ビーズ アッセイを最適化しています。4,5ここで紹介した方法の目的は、アッセイに perictyes を組み込むことで中津とヒューズを最適化壁画発芽血管内皮細胞のパラクリンおよび juxtracrine の役割に組み込むことができるアッセイに構築するには新規血管新生研究。ペリサイトは、細胞を維持する彼らの血管基底膜に埋め込まれているため内皮細胞に物理的に接触の近くにその役割で定義されている壁画のセルです。6ペリサイトおよび内皮細胞の複雑なクロス話-従事ノッチを含む経路のシグナルを介したシグナリング、Ang Tie2、PDGFRβ、TGFRβ、および他の多くの。7,8マウス モデルこれらのシグナル伝達経路の欠乏を示す悪い血管リモデリングにつながる胚の血管と血管系の機能不全を開発の貧しい周報道。7また、病的血管新生におけるペリサイトの役割は重要ですが、しばしば感謝です。たとえば、腫瘍血管の特徴にある血管より未熟な漏れ、貧しい周報道による機能不全。9それが劇的にペリサイトの有無は、腫瘍の血管の表現型に影響を与えるし、抗血管新生および抗腫瘍療法への応答の重要な仲介者は、提案されています。9このように、生体外の試金のペリサイトの役割を含むは内皮規制の重要なメカニズムをより完全にキャプチャするためのキーです。
現在、血管新生の研究に採用多くの体外と体外の試金が、それぞれに考慮する欠点があります。内皮細胞増殖や血管内皮移動分析など、いくつかは過度に簡略化し、焦点組織培養プラスチックの分離設定では 1 つの血管内皮機能に。10他のアッセイが発生する詳細 3 次元 (3 D) の設定でなどマトリゲル管形成アッセイ、10しかし、これらの試はまだ単純化移行・ デ ・ ノボ血管を形成する内皮細胞の機能に重点既存の血管から発芽するのではなく、構造体。さらに、これらのアッセイのどれもは壁画のセルの種類を組み込みません。前のヴィヴォモデル リング大動脈アッセイなどペリサイト ホスト器官に存在を組み込むことがありますが、これらのモデルの遺伝子操作はのノックアウト、トランスジェニック マウス モデルの生成の必要性のためにより挑戦的、関心の経路。発芽アッセイ ビーズは、内皮発芽、増殖、移行、および 3 D マトリックスでも吻合と内腔形成をモデル化するので最適です。4アッセイは内皮細胞またはより制御された設定でペリサイトの直接遺伝的変更を許可しながら、発芽の多くの異なる段階の機構の評価のために忠実にできます。発芽のビーズを含むフィブリン血栓とが簡単固定、染色、発芽; のさまざまな段階でイメージこれらもやしは、発芽のリアルタイム イメージングを実行するライブ イメージングの商工会議所にも配置できます。ここで紹介する方法は、深さの表現型解析における血管新生の基本的なメカニズムと血管新生中に活性化経路を徹底的に分析研究に最適です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、複雑なステージと徹底解明研究を実施する遺伝とイメージングの方法を採用する研究者を有効にすることによって血管新生を発芽の血液細胞間相互作用を特徴付けるための方法を示します。分析を実行すると、そのビーズの内皮塗着効率の間に起こるビーズ撹拌手順が不可欠です。貧しい内皮コーティングはビーズ ゲル注入前に次の朝のゴルフ ボールのような粗面を有?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
有用な議論、夫妻ビクトリア Bautch とジョシュア ブーシェに感謝し、標準的なビーズの最適化に関するアドバイス発芽アッセイ条件と発芽の試金のプロトコルを汚します。S.H.A. だったから国立科学研究所の一般医療下での補助金によって一部にはサポート 5T32 GM007092 賞を受賞します。
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
Riferimenti
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