분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합
Summary
이 프로토콜 선물 소설 체 외에서 구슬 시험을 더 적절 하 게 vivo에서 pericytes를 통합 하 여 신생을 돋 아의 프로세스 모델. 이 수정 구슬 분석 결과를 내 피 세포와 신생에 대 한 중요 한 벽화 셀 간의 heterotypic 세포 상호 작용을 더 충실 하 게 정리를 수 있습니다.
Abstract
신생 기존의 맥 관 구조에서 새로운 혈관의 성장 이며, embryogenesis 및 개발, 상처 치유, 종양 성장 및 전이를 포함 하 여 많은 생물학 과정 그리고 눈 및 심장 혈관 질병의 중요 한 구성 요소입니다. 신생의 생물학을 정리 하는 효과적인 생체 외에서 모델 필요 적절 하 게이 과정을 공부 하 고 새로운 치료 전략에 대 한 궁극적으로 대상이 될 수 있는 규제의 메커니즘을 식별 합니다. 비드 신생 분석 결과 이전 입증 되었습니다 내 피 돋 아의 여러 단계를 정리 생체 외에서. 그러나,이 분석 결과의 한계는 부족의 내 피-벽화 세포 상호 작용, 내 피 세포의 분자 및 phenotypic 규정 하는 열쇠는 vivo에서작동. 여기에서 주어진 프로토콜 구슬 신생 분석 결과에 벽화 셀의 설립에 대 한 방법론을 제시 하 고 돋 아 시험관중 내 피 세포와 pericytes의 단단한 협회를 보여줍니다. 프로토콜은 또한 효과적인 기계 론 적인 연구에 대 한 내 피 세포에 siRNA를 사용 하 여 대상 유전자의 입을 위한 방법론을 자세히 설명 합니다. 이 프로토콜 시험관에서 분석 결과 신생, 돋 아에 관련 된 다양 한 셀 형식 보다 적절 하 고 치료 평가 및의 소설 발견 더 순수-관련 플랫폼을 제공을 제공 하는 모두, 신생 규제의 메커니즘입니다.
Introduction
신생 적절 한 embryogenesis 및 상처 치유에 필수적 이며, 그것은 또한 암 진행1 및 관상 동맥 질환을 포함 하 여 수많은 질병에 주요 역할을 재생 합니다. 2 , 3 신생 정상적인 개발 중 발생 하는 방법을 그리고 pathologic 컨텍스트에서 활성화 하는 방법의 더 나은 이해 하는 데이 소설, 효과적인 치료제의 개발에 대 한 중요 합니다. 중요 한 단계와 비보에 신생에 관련 된 셀 형식을 정리 충실 한 생체 외에서 모델 더 나은 신생을 운전 하는 분자 메커니즘을 특성화 하 고 소설 발견을 연구원 허용 하는 데 필요한 내 피 규칙.
휴즈와 나카쓰 돋 아 비드 분석 결과 그들은 신생을 돋 아의 많은 알려진된 단계를 겪 습 증명을 최적화 했습니다. 4 , 5 여기에 제시 된 방법의 목적은 돋 아 내 피 세포 벽 세포의 paracrine 및 juxtracrine 역할에 통합 될 수 있도록 분석 결과에 perictyes를 통합 하 여 나카쓰와 휴즈에 의해 최적화 된 분석 결과 따라 구축 소설 신생 학문입니다. Pericytes는 벽 세포 세포를 유지 하는 가까운 신체 접촉 때문에 혈관 지하실 멤브레인에 포함 되는 그들의 내 피 세포와 그들의 역할에 의해 정의 되는. 6 Pericytes 및 내 피 세포에에서 관여 신호 노치를 포함 한 경로 통해 복잡 한 잡담 신호, 중앙 Tie2, PDGFRβ, TGFRβ, 및 많은 다른 사람. 7 , 8 마우스 모델 결핍이 신호 경로에 embryogenesis, 가난한 혈관 개장에 선도에서 맥 관 구조 및 기능 장애 맥 관 구조 개발의 가난한 pericyte 범위를 보여 줍니다. 7 또한, pathologic 신생에 pericytes의 역할은 중요 하지만 때로는 아래의 감사. 예를 들어 종양 맥 관 구조의 고유 기능은 혈관은 더 많은 새, 미 숙 하 고 가난한 pericyte 적용으로 인해 기능 장애입니다. 9 그것은 제안 되었습니다 pericytes의 유무 극적으로 종양 혈관의 표현 형에 영향 하는 항 혈관 신생을 antitumor 치료 응답의 중요 한 중재자. 9 따라서, 더 완전 하 게 내 피 규제의 중요 한 메커니즘을 캡처의 열쇠는 생체 외에서 분석 실험에서 pericytes의 역할을 포함 하 여.
비록 많은 시험관 및 전 비보 분석 현재 신생 공부를 고용, 각각에 고려해 야 할 결점 있다. 일부 내 피 확산 등 내 피 마이그레이션 분석 실험, 지나치게 단순화 하 고 초점 조직 문화 플라스틱에 격리 된 환경에서 한 내 피 기능에. 10 다른 분석와 같은 Matrigel 관 형성 분석 결과,10 만이 분석 실험은 여전히 간소화 마이그레이션할 드 노 보 혈관 형성 내 피 세포의 기능에 더 많은 초점 더 많은 3 차원 (3D) 설정, 발생 기존의 맥 관 구조에서 돋 아와 반대로 구조. 또한,이 분석 실험의 벽 세포 유형 통합. Ex vivo 모델 링 대동맥 분석 결과 pericytes 호스트 기관에 통합 수행 하는 있지만 이러한 모델의 유전자 조작의 녹아웃 또는 유전자 변형 마우스 모델 생성의 필요성 때문에 훨씬 더 도전적인는 관심 경로 분석 결과 돋 아 비드 모델 내 피 돋 아, 확산, 마이그레이션, 그리고 3 차원 매트릭스에도 문 합 및 루멘 형성 하기 때문에 이상적 이다. 4 분석 결과 충실 하 게 돋 아, 내 피 세포 또는 더 많은 제어 설정에서 pericytes의 직접적인 유전 수정에 대 한 허용 하면서의 많은 다른 단계 기계적 평가 대 한 수 있습니다. 돋 아 구슬 포함 된 섬유 소 혈전 쉽게 고정, 스테인드, 고 수 돋 아;의 여러 단계에서 몇 군데 이 새싹이 돋 아의 실시간 이미지를 수행 하는 라이브 영상 실에 배치할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법론 공부 깊이 형질에 통해 신생의 기본 메커니즘 및 신생 중 활성화 통로의 철저 한 분석에 이상적입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 특성화 복잡 한 단계와 철저 한 기계적 조사에 유전과 이미징 접근을 연구 함으로써 신생을 돋 아의 heterotypic 세포 상호 작용을 위한 메서드를 제공 합니다. 분석 결과 수행할 때 그 구슬의 효율적인 내 피 코팅 동안에 일어난 구슬 동요 단계 필수적 이다. 불 쌍 한 내 피 코팅은 구슬 골프 공 처럼 거친 표면 젤 이식 전에 다음날 아침 고 대신 완전히 부드러운 표시 나타나지 않는 경우?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 유용한 토론에 대 한 박사 빅토리아 Bautch와 조슈아 바우처를 감사 하 고 표준 비드 최적화에 대 한 조언을 시험 조건 및 얼룩 프로토콜 분석 결과 돋 아 돋 아. S.H.A. 국립 과학 연구소에서의 일반 의료에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 5T32 GM007092 수상.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
Riferimenti
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