Questa presenta protocollo una perlina di romanzo in vitro test che più modelli in modo appropriato il processo di in vivo l'angiogenesi di germogliatura incorporando i periciti. Questa modifica consente il dosaggio di perlina di ricapitolare più fedelmente le interazioni cellulari eterotipiche tra cellule endoteliali e cellule murale che sono critiche per l'angiogenesi.
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Articolo metodologico
Incorporare i periciti un tallone di cellule endoteliali Assay di germogliatura
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'angiogenesi è la crescita di nuovi vasi dal sistema vascolare pre-esistente ed è una componente importante di molti processi biologici, compreso l'embriogenesi e sviluppo, guarigione delle ferite, la crescita del tumore e metastasi e malattie oculari e cardiovascolari. Efficace in vitro modelli che ricapitolano la biologia dell'angiogenesi sono necessari per studiare questo processo in modo appropriato e di identificare i meccanismi di regolazione che possono essere in ultima analisi mirate per nuove strategie terapeutiche. L'analisi di angiogenesi della perla è stato dimostrato in precedenza di ricapitolare le fasi multiple di germogliatura endoteliale in vitro. Tuttavia, una limitazione di questo test è una mancanza di endoteliali – interazioni cellula murale, , che sono la chiave per la regolazione molecolare e fenotipica delle cellule endoteliali funzionano in vivo. Il protocollo dato qui presenta una metodologia per l'incorporazione delle cellule murale il dosaggio di angiogenesi perlina e dimostra una stretta associazione delle cellule endoteliali e periciti durante la germinazione in vitro. Il protocollo dettaglia anche una metodologia efficace silenziamento dei geni bersaglio utilizzando siRNA in cellule endoteliali per studi meccanicistici. Complessivamente, questo protocollo fornisce un'analisi in vitro che in modo più appropriato modelli i tipi di cellule diverse coinvolti nell'angiogenesi di germogliatura e fornisce una piattaforma più fisiologicamente rilevanti per la valutazione terapeutica e romanzo scoperta di meccanismi di regolazione dell'angiogenesi.
Introduzione
L'angiogenesi è vitale per l'embriogenesi appropriato e la guarigione della ferita, e svolge anche ruoli chiave nelle numerose malattie compreso la malattia dell'arteria coronaria e1 progressione di cancro. 2 , 3 avere una migliore comprensione di come l'angiogenesi si verifica durante lo sviluppo normale, e come esso viene riattivato in contesti patologici, è fondamentale per lo sviluppo del romanzo, terapeutica efficace. Fedele in vitro modelli che ricapitolano le tappe importanti e tipi cellulari coinvolti nell'angiogenesi in vivo sono necessari per permettere ai ri....
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Protocollo
Giorno 1:
1. transitori di transfezione delle cellule endoteliali
- Se si desidera eseguire una trasfezione transiente di umano ombelicale vena Endothelial cellule (HUVEC) utilizzando oligonucleotidi regolazione genica (es. micro-RNA o short interfering RNA (siRNA)) e il reagente appropriato lipofectamine secondo istruzioni del produttore.
Nota: Questo protocollo ha avuto grande successo esecuzione inversione transfezioni con sequenze di siRNA personalizzato e un reagente di transfezione commerciale (Vedi materiali tavolo). Gli autori non hanno testato altri protocolli di transfezione e reagenti con ques....
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Risultati
Questo protocollo consente una stretta associazione di due cella tipi in vitro, e la presenza dei pericytes integra l'avvenimento di germogliatura (Figura 1A, B). Il protocollo consente inoltre efficace silenziamento (ad es. tramite l'interferenza del RNA) di un gene di interesse in un tipo di cella di interesse quali (VEGFA specificamente in cellule endoteliali) o PDGFRβ nei periciti7,
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Discussione
Questo protocollo presenta un metodo per caratterizzare le fasi complesse e interazioni eterotipiche cellulari di germogliatura angiogenesi attivando il ricercatore di impiegare approcci genetici e imaging per condurre indagini approfondite meccanicistiche. Quando si esegue il test, è essenziale che efficiente rivestimento endoteliale delle perle si svolge durante il tallone punti di agitazione. Rivestimento endoteliale poveri saranno evidente, se le perline non sembrano avere una superficie ruvida di golf sfera-come la .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la d. ssa Victoria Bautch e Joshua Boucher per utili discussioni e consigli su come ottimizzare il tallone standard spuntano condizioni di dosaggio e un saggio di germogliatura protocollo di colorazione. S.H.A. è stato sostenuto in parte da una sovvenzione dal National Institute of General Medical Sciences sotto Premio 5T32 GM007092.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Puntali per pipette sterili | VWR | ||
| Pipettatori | Eppendorf | ||
| Kit completo di proiettili per terreni EGM2 | Lonza | CC-3162 | Terreni HUVEC |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Terreni |
| DMEM | Gibco 11965118 | Terreni NHLF | |
| PBS per colture tissutali | Gibco | 14190-144 | Senza magnesio e calcio |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | Per il sollevamento HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | Per il sollevamento 10T 1/2 e NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microsfere portanti | Sigma | C3275 | |
| Piastre rivestite per colture tissutali da 6 e 10 cm | Corning | ||
| Fibrinogeno da plasma bovino | Sigma | F8630 | |
| Trombina | Sigma | t9549 | |
| Aprotinina | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Incubatore per colture tissutali e cappa | |||
| Piastre con fondo in vetro a 24 pozzetti | MatTek | P24G1.513F | Le piastre con fondo in vetro sono necessarie solo se i germogli devono essere visualizzati. In caso contrario, è accettabile anche la plastica per colture tissutali. |
| di filtrazione sterile |
Riferimenti
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M.
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Ristampe e permessi
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