폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화
Summary
프로토콜은 차별화에 생체 재료의 강성 효과 확산의 조사와 펩타이드, 없이 투입 했다 다양 한 뻣 뻣 함과 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 hydrogels를 준비 하 여 줄기 세포입니다. hydrogels 강성 가교에 의해 통제 되었다.
Abstract
확산에 생체 재료의 강성과 줄기 세포의 분화와 같은 물리적 단서의 효과가 여러 연구자에 의해 조사 했다. 그러나,이의 대부분 polyacrylamide hydrogels 그들의 연구에서 줄기 세포 배양에 대 한 사용. 따라서, 그들의 결과 그 결과 polyacrylamide의 특정 한 특성에서와 생체 재료의 물리적 큐 (강성)에서 발생 될 수 있습니다 때문에 논란이 있습니다. 여기, 우리가 polyacrylamide, 다양 한 줄기, 인간 미 발달 줄기 (ES) 세포를 포함 하 여 셀 및 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포를 배양 수 있습니다 어디를 기반으로 하지 hydrogels를 준비 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 다양 한 강성과 Hydrogels 강성 가교 시간을 변경 하 여 가교 정도 의해 제어와 bioinert 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 (P-IA)에서 준비 되었다. 펩타이드 기질에서 파생 하지 않고 투입 P-IA hydrogels 줄기 세포 배양 및 분화에 대 한 미래의 플랫폼으로 조사 되었다. 문화와 액체 양수 줄기 세포, 줄기 세포 지방이 많은 파생, 인간 ES 세포, 및 인간 iPS 세포의 통로 여기에 설명 되어 있습니다. 펩타이드 P-IA hydrogels가 보였다 우수한 공연, 그들의 강성 속성에 의해 유도 했다. 이 프로토콜의 소재, 강성 속성 및 마지막으로, 이종 무료 문화 조건을 사용 하 여 줄기 세포 운명에 미치는 영향을 제어 하는 함께 그들의 표면 조작, 합성을 보고 합니다. 최근 연구를 바탕으로, 그러한 수정된 기판 지원 하 고 다른 연계; 다양 한 줄기 세포 라인의 운명을 직접 미래의 플랫폼으로 작동할 수 있다 또한, 재생성 하 고 잃어버린된 기관 또는 조직의 기능을 복원 합니다.
Introduction
세포와 줄기 세포, 특히 인간 유도 만능 (iPS) 세포와 인간 배아 줄기 (ES) 세포의 장기 확산의 특정 계보에 줄기 세포 분화의 운명을 억제제, 성장 요인에 의해 통제 될 것으로 알려져 고 / 또는 문화 미디어에 작은 생리 활성 분자입니다. 최근, 생체 재료, 특히 셀 문화 생체 재료의 강성의 물리적 신호 줄기 세포 확산 그리고 감 별 법1,2,의 운명을 인도 하는 중요 한 요소가 될 인정을 받고 있다 3,4,,56. 따라서, 여러 연구자 다양 한 강성과 polyacrylamide hydrogels를 사용 하 여 주로 hydrogels, 차별화에 교양 줄기 세포의 운명을 조사 하기 시작 했습니다.
생체 재료의 강성은 초점 접착, 세포 형태학, 셀 형 및 줄기 세포 접착, 2 차원 (2 차원) 재배1,2,,35에 (서) 특히 제어할 수 있습니다. 줄기 세포에 의해 생체 재료의 메카노 감지 일반적으로 초점 접착 integrin 수용 체를 통해 신호에 의해 제어 됩니다. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA 종속 수축 말라의 골격의 중요 한 역할을 2 차원 셀 재배 시스템3,,45, 에서 줄기 세포의 mechanosensing 과정에서 7,,89,,1011.
Engler와 그의 동료 성인 줄기 세포, 골 수 줄기 (BMS) 세포는 특정 조직에 유사한 강성과 셀 문화 생체에 재배 등에서 유래 하는 세포로 분화 하는 경향이 있는 재미 있는 개념 개발 특정 조직5. BMS 셀 2 차원 소프트 polyacrylamide hydrogels 콜라겐 유형 I (강성 뇌 조직의 비교) 확장 미디어에 저절로 BMS 셀에 경작 하는 반면 초기 신경 혈통으로 차별화 하는 유도 했다 코팅에 인 큐베이 팅 collagenous 뼈 조직 또는 근육의 강성과 hydrogels 2 차원 polyacrylamide hydrogels3,5에 각각, myocytes 및 osteoblasts의 이른 계보에 차별화를 유도 하는 것 발견 되었다. 많은 연구 자들은 분화의 줄기 세포 운명 조사 polyacrylamide에 교양 hydrogels 콜라겐 움직일 유형 I12,,1314,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20 , 그러나 21., 그것은 언급 한다는 몇 가지 모순 보고1,,1822,,2324 Engler에 의해 제안 하는 잘 알려진 아이디어에 대 한 존재 외. 5 이것이 Engler의 아이디어5 polyacrylamide hydrogels에 전적으로 개발 되었다 및 그들의 결과의 물리적 큐 (강성) 아니라 전적으로 및 소재 (polyacrylamide)의 특정 한 특성에서 유래 하기 때문에 소재입니다. 따라서, 그것은의 강성은 hydrogels의 가교에 의해 통제 될 수 있다, 하이드로 겔의 다른 유형을 개발 하는 것이 중요. 이 위해 bioinert hydrogels 개발 되었다는 가교 정도는 변화 가교 시간25, 이전에 의해 통제 되었다 다른 강성으로 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 (P-IA)에서 준비 했다 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. 줄기 세포 nonmodified P-IA hydrogels P-IA hydrogels 세포 외 매트릭스 (ECMs)와 펩타이드 융합에 재배 될 수 있다. 이전 연구25의 경우, 인간 조 혈 줄기 세포 (hHSCs) 탯 줄 혈액에서 다른 강성 값에서 3 kPa fibronectin 또는 한 펩타이드에서 파생 된 30 kPa 저장 모듈러스와 P-IA hydrogels에 재배 했다 fibronectin (CS1, EILDVPST)는 P-IA hydrogels에 융합 되었다. HHSCs의 배 확장 높은 비보 전 P-IA hydrogels CS1 또는 30 kPa2512 kPa에서 배열 하는 중간 강성 표시 fibronectin 투입에서 관찰 되었다.
인간 iPS와 ES 세포 수 수 재배 기존의 조직 문화 폴리스 티 렌 (TCP) 요리33,34 에 인간의 ES와 iPS 세포 vitronectin 등 그들의 pluripotency를 유지 하기 위해 laminin ECMs, 특정 바인딩이 필요로 하기 때문에 중 장기적인 문화. 따라서, 최적의 강성 특성을 가진 P-IA hydrogels 펩타이드 융합의 여러 구조 설계 하 고 단일 체인, 공동 세그먼트와 단일 체인, 공동 세그먼트와 분기 종류 듀얼 체인의 형성에 체인32. 펩타이드 시퀀스 integrin glycosaminoglycan 바인딩 도메인 소프트웨어의 선정 됐다. 약 25 kPa에서 저장 탄성 률을가지고, 듀얼 체인 또는 공동 세그먼트, vitronectin에서 파생 된 펩타이드와 융합 하는 P-IA hydrogels 이종 무료 및 화학 이상 12 구절에 대 한 인간의 ES와 iPS 세포의 장기 문화 지원 정의 된 조건32. 공동 세그먼트와 듀얼 체인은 hydrogels에 세포 접착 분자 확산을 촉진 하 고 인간의 ES와 iPS의 pluripotency 세포32. 여기, (와 함께 공기에 젖은 조건 하에서 측정 되었다 30 kPa에 10 kPa의 저장 모듈러스) P-IA hydrogels를 준비 하기 위한 프로토콜 융합 펩타이드 없이 또는 소프트웨어를 설명. 문화 및 여러 줄기 세포 (를 포함 하 여 액체 양수 줄기 세포, 줄기 세포 지방이 많은 파생, 인간 ES 세포, 및 인간 iPS 세포)를 통과 하는 방법에 표시 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
P-i A-oligoECM 및 다양 한 강성과 P-아이오와-ECM hydrogels 인간의 ES와 이종 무료 조건에 이상 10 구절 뿐만 아니라 인간의 AFS 셀, 광고 셀의 문화에 대 한 그들의 pluripotency를 유지 하는 iPS 세포의 장기 확장을 위해 개발 되었다 그리고 조 혈 줄기 세포25,,2832. P-IA hydrogels oligoECM와 함께 움직일 수는 차별화의 운명과 기본 세포로 서 줄기 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 부분적으로 부여 번호 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006, 104-2221-E-008-107-MY3 아래 과학과 기술, 대만 의해 지원 됩니다. 이 연구는 대만 Landseed 병원 프로젝트 (NCU-LSH-105-A-001)에 의해 또한 지원 되었다. 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본에서 과학 연구 (숫자 15 K 06591)에 대 한 특정도 인정 했다. A. 히구치 대학원 및 연구, 킹 사우드 대학, 리야드 11451, 사우디아라비아 왕국에 대 한 국제 과학 파트너십 프로그램 (ISPP-0062) 부회장 Rectorate에 대 한 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Riferimenti
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
- Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
- Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
- Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
- Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
- Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
- Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
- Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
- Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
- Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
- Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
- Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
- Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
- Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
- Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
- Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
- Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
- Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
- Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
- Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).
