התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית
Summary
פרוטוקול מוצג להכין hydrogels אסיד פוליוויניל אלכוהול-co-itaconic עם נוקשות בדרגות שונות, אשר היו הושתל עם ובלי oligopeptides, לחקור את השפעת הנוקשות של biomaterials על בידול והתפשטות תאי גזע. הנוקשות של hydrogels היה בשליטת הזמן crosslinking.
Abstract
ההשפעה של סימנים פיזיים, כגון את הנוקשות של biomaterials על התפשטות התמיינות של תאי גזע, נחקר על ידי מספר חוקרים. עם זאת, רוב החוקרים הללו השתמשו לזיהוי hydrogels לתרבות תאי גזע בלימודיהם. לכן, התוצאות שלהם הם שנויים במחלוקת כי תוצאות אלה עשוי לנבוע המאפיינים הספציפיים של לזיהוי ולא הסימן הפיזי (קשיות) של biomaterials. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להכנת hydrogels, אשר אינם מבוססים על לזיהוי, איפה שונים גזע תאים כולל תאי גזע עובריים אנושיים (ES), תאי גזע (iPS) pluripotent המושרה האנושית, יכול להיות תרבותי. Hydrogels עם קשיות שונות הוכנו פוליוויניל bioinert אלכוהול-co-itaconic חומצה (P-IA), עם נוקשות בשליטת crosslinking תואר על-ידי שינוי crosslinking זמן. Hydrogels P-IA הושתל עם ובלי oligopeptides נגזר מטריצה חוץ-תאית נחקרו כפלטפורמה בעתיד ליצירת תאי גזע תרבות ובידול. התרבות ועל מעבר של תאי גזע נוזל מי השפיר, נגזר שומן בתאי גזע, התאים של ES האדם ותאים iPS האנושי מתואר באופן מפורט כאן. Hydrogels oligopeptide P-IA הראה הופעות מעולה, אשר היו המושרה על ידי תכונותיהם נוקשות. פרוטוקול זה מדווח הסינתזה של biomaterial, מניפולציה השטח שלהם, יחד עם שליטה המאפיינים נוקשות, ולבסוף, שלהם השפעה על גורל תאי הגזע באמצעות תרבות קסנו ללא תנאים. בהתבסס על מחקרים שנעשו לאחרונה, סובסטרטים ששונו כזה יכול להתנהג כמו פלטפורמות בעתיד לתמוך ולהנחות את גורלו של תאי גזע שונות, לקו קישורים שונים; ואני עוד יותר, להתחדש ולשחזר את הפונקציות של לאיבוד האיבר או הרקמה.
Introduction
גורלו של התמיינות תאי גזע לתוך שושלת ספציפי של תאים והתפשטות לטווח ארוך של תאי גזע, תאים pluripotent המושרה אנושי במיוחד (iPS), תאי גזע עובריים אנושיים (ES), ידוע ולהיות מוסדר על ידי מעכבי, גורמי גדילה, ו / או מולקולות קטנות ביואקטיביות בתקשורת תרבות. לאחרונה, הותאם הפיזי של biomaterials, במיוחד את הנוקשות של התא תרבות biomaterials, הוכרו להיות גורם חשוב להדריך את גורלו של תאי גזע התפשטות ובידול1,2, 3,–4,–5,–6. לכן, מספר חוקרים החלו לחקור את גורלו של תאי גזע, אשר מתורבתים על hydrogels, על בידול, בעיקר באמצעות לזיהוי hydrogels עם נוקשות בדרגות שונות.
הנוקשות של biomaterials ניתן לשלוט הדבקויות מוקד, מורפולוגיה תאים, תא פנוטיפ, אדהזיה לתאי גזע, בפרט דו-ממדית (2-D) טיפוח1,2,3,5. Mechano חישה של biomaterials על ידי תאי גזע נשלטת בדרך כלל על ידי מוקד אדהזיה איתות באמצעות קולטנים אינטגרין. NMMIIA, nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן contractility תלויי-IIA של שלד התא של אקטין משחק תפקיד קריטי בתהליך mechanosensing של תאי גזע תא 2-D טיפוח מערכות3,4,5, 7,8,9,10,11.
אנגלר ועמיתיו פיתחו רעיון מעניין כי תאי גזע בוגרים, כגון תאי גזע (BMS) מח עצם מעובדות על התא תרבות biomaterials עם מנדנד דומה לזה של רקמות ספציפיות, נוטים להבדיל לתוך תאים שמקורם רקמות ספציפיות5. עב מ תאים מתפשט על hydrogels בדו-ממד לזיהוי רך מצופה קולגן סוג אני (עם מנדנד לזו של רקמות המוח) במדיה הרחבה היו באופן ספונטני המושרה להבדיל לתוך שושלות נוירון מוקדם, ואילו תאים BMS תרבותי- hydrogels עם מנדנד דומה לזה של שרירים או עצמות סילוק רקמות נמצאו לזירוז בידול לתוך שושלות מוקדם של תאי שריר, תאי העצם, בהתאמה, בדו-ממד לזיהוי hydrogels3,5. חוקרים רבים חקרו את גורלו תאי גזע של בידול תרבותי על לזיהוי hydrogels מרותק למיטה עם קולגן מסוג I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. עם זאת, יצוין כי קצת סותרות מדווח1,18,22,23,24 קיים הרעיון של ידועים שהציע אנגלר et al. 5 זה כי הרעיון של אנגלר5 פותחה אך ורק על לזיהוי hydrogels התוצאות שלהם להיות שמקורם מן המאפיינים הספציפיים של biomaterial (לזיהוי), לא אך ורק מתוך הסימן הפיזי (קשיות) של biomaterial. לכן, חשוב לפתח סוג אחר של הידרוג, אשר הקשיחות יכול להיות נשלט על ידי crosslinking של hydrogels. למטרה זו, פותחו bioinert hydrogels, אשר הוכנו אלכוהול-co-itaconic פוליוויניל חומצה (P-IA) עם קשיחות שונות, אשר נשלטה על-פי מידת crosslinking עם המשתנים crosslinking זמן25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. תאי גזע יכולים לטפח את hydrogels P-IA nonmodified, כמו גם hydrogels P-IA הושתל עם מטריצה חוץ-תאית (ECMs), oligopeptides. הקודם המחקר25, hematopoietic תאי גזע אנושי (hHSCs) של דם טבורי היו מעובדות על P-IA hydrogels עם ערכים קשיחות שונות ועד 30 מודולוס אחסון של kPa, איפה fibronectin או oligopeptide נגזרת kPa 3 fibronectin (CS1, EILDVPST) היה הושתל על גבי hydrogels P-IA. גבוהה שמחוץ קיפול הרחבה של hHSCs נצפתה ב hydrogels P-IA הושתל CS1 או fibronectin, שהציגה של נוקשות ביניים ועד 12 kPa 30 kPa25.
IPS אנושיים ותאי ES לא יכול להיות מעובדות על-קונבנציונאלי תרביות רקמה פוליסטירן (TCP) מנות33,34 מכיוון ES האדם ואת תאי iPS דורשים קשירה ספציפי ECMs, כגון vitronectin או laminin כדי לשמור על pluripotency שלהם במהלך תרבות לטווח ארוך. לכן, מספר מבני הושתל oligopeptide hydrogels P-IA עם מאפיינים של האופטימלית נוקשות היו תוכנן והכינו תצורות של שרשרת אחת, שרשרת אחת עם קטע משותף, שרשרת כפולה עם קטע משותף, סוג הקנים שרשרת32. רצפים Oligopeptide נבחרו מתחומים אינטגרין, גליקוזאמינוגליקן-איגוד של ECMs. Hydrogels P-IA הושתל עם vitronectin, נגזר oligopeptides עם שרשרת כפולה או קטע משותף, אשר יש מודולוס אחסון של kPa כ 25, נתמך התרבות לטווח ארוך של ES האדם ואת תאי iPS עבור המעברים מעל 12 ללא קסנו וכימיים התנאים מוגדרים32. קטע משותף, שרשרת כפולה עם התא מולקולות אדהזיה על hydrogels הקלו ההתפשטות ו pluripotency של ES ואנושי iPS תאים32. . הנה, פרוטוקול להכנת hydrogels P-IA (עם מודולוס אחסון של 10 kPa ל kPa 30, אשר נמדדה בתנאים רטובים באוויר) הושתל עם או בלי oligopeptides או ECMs מתואר. כיצד תרבות, בקטע מספר תאי גזע (כולל תאי גזע נוזל מי השפיר, נגזר שומן בתאי גזע, התאים של ES האדם ותאים iPS אנושי) מוצג.
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-oligoECM ו- hydrogels P-IA-ECM עם קשיות שונות פותחו לצורך הרחבת לטווח ארוך ES האדם ותאים iPS שמירה על pluripotency שלהם מעברים מעל לעשר בתנאים קסנו-חופשית, כמו גם עבור התרבות של תאים אנושיים AFS, תאים המודעות, תאי גזע hematopoietic25,28,32. Hydrogels P-IA. מרותק למיטה עם oligoECM ה?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן בחלקו על ידי משרד המדע הטכנולוגיה, טייוואן תחת גרנט מספרי 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 ו 104-2221-E-008-107-MY3. מחקר זה גם נתמך על ידי הפרויקט בבית החולים Landseed טייוואן (NCU-איש-105-A-001). מענק הסיוע למחקר מדעי (מספר 15K 06591) של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה של יפן הוא גם הודה. א Higuchi רוצה להכיר עבור Rectorate סגן התוכנית השותפות המדעית הבינלאומית (ISPP-0062) עבור לימודים לתואר שני ושלישי ומחקר, אוניברסיטת המלך סעוד, ריאד 11451, ממלכת ערב הסעודית.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Riferimenti
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
- Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
- Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
- Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
- Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
- Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
- Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
- Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
- Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
- Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
- Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
- Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
- Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
- Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
- Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
- Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
- Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
- Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
- Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
- Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).
