Menselijke pluripotente stamcel cultuur op Polyvinyl Alcohol-Co-itacon zuur Hydrogels met verschillende stijfheid onder voorwaarden Xeno-gratis
Summary
Een protocol is bedoeld om te bereiden polyvinyl alcohol-co-itacon zuur hydrogels met verschillende stijfheid, die waren geënt met en zonder oligopeptides, te onderzoeken van het effect van de stijfheid van biomaterialen op de differentiatie en de verspreiding van de cellen van de stam. De stijfheid van de hydrogels werd gecontroleerd door het crosslinking tijd.
Abstract
Het effect van lichamelijke signalen, zoals de stijfheid van biomaterialen op de proliferatie en differentiatie van stamcellen, is onderzocht door verschillende onderzoekers. De meeste van deze onderzoekers hebben echter polyacrylamide hydrogels gebruikt voor cel van de stam cultuur in hun studie. Daarom is hun resultaten zijn omstreden omdat deze resultaten afkomstig van de specifieke kenmerken van de polyacrylamide en niet van de fysieke keu (stijfheid) van de biomaterialen zijn mogelijk. Hier beschrijven we een protocol voor het voorbereiden van de hydrogels, die niet gebaseerd zijn op polyacrylamide, waar verschillende stuurpen, cellen, met inbegrip van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen en menselijk geïnduceerde pluripotente (iPS) stamcellen, kan worden gekweekt. Hydrogels met verschillende stijfheid waren bereid uit bioinert polyvinyl alcohol-co-itacon zuur (P-IA), met stijfheid gecontroleerd door crosslinking mate door het crosslinking tijd wijzigen. De P-IA hydrogels geënt met en zonder oligopeptides afgeleid van extracellulaire matrix werden onderzocht als een toekomstige platform voor cultuur van de cel van de stam en differentiatie. De cultuur en de passage van vruchtwater vloeistof stamcellen, cellen van de stam van de adipeus afkomstige, menselijke ES-cellen en menselijke iPS cellen wordt hier in detail beschreven. De oligopeptide P-IA hydrogels bleek superieur voorstellingen, die werden veroorzaakt door hun stijfheid eigenschappen. Dit protocol rapporteert de synthese van de biomaterial, hun oppervlakte manipulatie, samen met de beheersing van de stijfheid eigenschappen en ten slotte hun invloed op het lot van de cel van de stam met behulp van xeno-vrije cultuuromstandigheden. Gebaseerd op recente studies, kunnen dergelijke gemodificeerde substraten fungeren als toekomstige platformen te ondersteunen en het lot van verschillende stamcellen lijn naar verschillende verbanden; en verder, regenereren en de functies van de verloren orgaan of weefsel herstellen.
Introduction
Het lot van de cel van de stam differentiatie in een bepaalde bloedlijn van cellen en de lange termijn proliferatie van cellen van de stam, vooral menselijke geïnduceerde pluripotente (iPS) cellen en cellen van menselijke embryonale stamcellen (ES), is bekend door remmers, groeifactoren, worden gereguleerd en / of kleine biologische actieve moleculen in kweekmedia. Onlangs, de fysieke signalen van de biomaterialen, met name de stijfheid van de cel cultuur biomaterialen, zijn erkend als een belangrijke factor voor het begeleiden van het lot van de cel van de stam proliferatie en differentiatie1,2, 3,4,5,6. Daarom zijn verschillende onderzoekers begonnen met het onderzoeken van het lot van stamcellen, die worden gekweekt op hydrogels, op de differentiatie, voornamelijk met behulp van polyacrylamide hydrogels met verschillende stijfheid.
De stijfheid van biomaterialen kunt focal verklevingen, cel morfologie, cel fenotype en hechting van de cel van de stam, met name in de teelt van tweedimensionale (2D)1,,2,,3,5. Mechano-sensing van biomaterialen door stamcellen wordt over het algemeen beheerd door focal hechting signalering via integrine receptoren. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-afhankelijke contractility van het cytoskelet van actine speelt een cruciale rol in het proces van de mechanosensing van stamcellen in 2-D-cel teelt systemen3,4,5, 7,8,9,10,11.
Engler en zijn collega’s ontwikkelde een interessant idee dat adulte stamcellen, zoals het beenmerg (BMS) stamcellen gekweekt op cel cultuur biomaterialen met een soortgelijke stijfheid aan die van specifieke weefsels, de neiging om te differentiëren in cellen die afkomstig is van specifieke weefsels5. BMS cellen geïncubeerd op 2D-zachte polyacrylamide hydrogels bekleed met collageen type I (met een stijfheid die vergelijkbaar is met die van de hersenen weefsels) in expansie media werden spontaan veroorzaakte om te differentiëren in vroege neuron lineages, overwegende dat BMS cellen gekweekt op hydrogels met een vergelijkbaar met die van de spier of collagene bot weefsels stijfheid bleken voor het opwekken van differentiatie in vroege lineages van myocytes en botcellen, respectievelijk op 2D-polyacrylamide hydrogels3,5. Veel onderzoekers hebben onderzocht het lot van de cel van de stam van differentiatie gekweekte op polyacrylamide hydrogels geïmmobiliseerd met collageen type ik12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. echter, dient te worden opgemerkt dat sommige tegenstrijdige1,verslagen18,22,23,24 bestaan voor het bekende idee gesuggereerd door Engler et al. 5 dit is omdat de Engler idee5 werd ontwikkeld uitsluitend op polyacrylamide hydrogels en hun resultaten zijn afkomstig uit specifieke kenmerken van de biomaterial (polyacrylamide), en niet alleen uit de fysieke keu (stijfheid) van de biomaterial. Daarom is het belangrijk om een ander type hydrogel, waarvan de stijfheid kan worden gecontroleerd door crosslinking van de hydrogels. Voor dit doel, werden bioinert hydrogels ontwikkeld, en die verkrijging van polyvinyl alcohol-co-itacon zuur (P-IA) met een andere stijfheid, die werd gecontroleerd door de crosslinking graad met een veranderende crosslinking tijd25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de cellen van de stam op nonmodified P-IA hydrogels, evenals P-IA hydrogels geënt met extracellulaire matrices (ECMs) en oligopeptides kunnen worden gekweekt. In een eerdere studie25, werden menselijke hematopoietische stamcellen (hHSCs) uit het navelstrengbloed gekweekt op P-IA hydrogels met verschillende stijfheid waarden variërend van een 3 kPa tot 30 kPa opslag modulus waar fibronectine of een oligopeptide afgeleid van fibronectine (CS1, EILDVPST) was geënt op de P-IA hydrogels. Hoge ex vivo vouw uitbreiding van hHSCs werd waargenomen in de P-IA hydrogels geënt met CS1 of fibronectin, die een tussenliggende stijfheid variërend van 12 kPa tot 30 kPa25weergegeven.
Menselijke iPS en ES-cellen niet kunnen worden geteeld op conventionele weefselkweek polystyreen (TCP) gerechten33,34 omdat menselijke ES en iPS cellen specifieke binding aan ECMs, zoals vitronectin of laminin vereisen om hun pluripotent tijdens langetermijnkweek. Daarom werden verschillende structuren van oligopeptide-geënt P-IA hydrogels met optimale stijfheid kenmerken ontworpen en voorbereid in formaties van één keten, één keten met een gezamenlijke segment, een dubbele ketting met een gezamenlijke segment en een vertakt-type keten32. Oligopeptide sequenties werden geselecteerd uit integrine – en glycosaminoglycaan-bindende domeinen voor ECMs. De P-IA hydrogels geënt met vitronectin afkomstige oligopeptides met een dubbele ketting of gezamenlijke segment, die hebben een opslag-modulus bij ongeveer 25 kPa, ondersteund de langetermijnkweek van menselijke ES en iPS-cellen voor meer dan 12 passages onder xeno-vrij en chemische omschreven voorwaarden32. Het gecombineerde segment en de dubbele ketting met celadhesie-moleculen op de hydrogels vergemakkelijkt de proliferatie en pluripotent van menselijke ES en iPS cellen32. Hier, een protocol voor het voorbereiden van P-IA hydrogels (met een opslag modulus van 10 kPa naar 30 kPa, die werd gemeten onder natte omstandigheden in de lucht) geënt met en zonder oligopeptides of ECMs wordt beschreven. Hoe cultuur en doorgang van verschillende cellen van de stam (met inbegrip van vruchtwater vloeistof stamcellen, adipeus-afgeleide cellen van de stam, menselijke ES-cellen en cellen van menselijke iPS) wordt weergegeven.
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-oligoECM en P-IA-ECM hydrogels met verschillende stijfheid werden ontwikkeld voor de lange termijn uitbreiding van menselijke ES en iPS cellen handhaven hun pluripotent voor meer dan tien passages van xeno-vrij voorwaarden, alsmede voor de cultuur van menselijke cellen bij de AFS, advertenties cellen, en hematopoietische stamcellen25,28,32. P-IA hydrogels geïmmobiliseerd met oligoECM zijn een uitstekende kandidaat is voor …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd het gedeeltelijk ondersteund door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan onder grant nummers 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 en 104-2221-E-008-107-MY3. Dit onderzoek werd ook ondersteund door het Taiwan Landseed ziekenhuis Project (NCU-LSH-105-A-001). Een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (nummer 15K 06591) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan wordt ook erkend. A. Higuchi wil erkennen voor de internationale wetenschappelijke Partnership Program (IDPB-0062) Vice ceremoniezaal voor Graduate Studies en onderzoek, Universiteit van Koning Saoed Riyad 11451, Koninkrijk van Saoedi-Arabië.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Riferimenti
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
- Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
- Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
- Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
- Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
- Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
- Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
- Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
- Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
- Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
- Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
- Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
- Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
- Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
- Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
- Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
- Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
- Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
- Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
- Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).
