Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニル アルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化
Summary
増殖と分化に生体材料の剛性の影響を調査するため、オリゴペプチド、接木されたさまざまな剛性とポリビニル アルコール co イタコン酸ゲルを準備するためのプロトコルを表示します。幹細胞。ゲルの剛性は、架橋時間によって制御されました。
Abstract
幹細胞の分化増殖に対する生体材料の剛性などの物理的な手がかりの効果は、いくつかの研究が検討されています。ただし、これらの調査のほとんどは、彼らの研究の幹細胞文化のポリアクリルアミドのゲルを使用しています。したがって、これらの結果かもしれないと生体材料の物理的なキュー (剛性) ではなく、ポリアクリルアミドの特定の特性から発生するため、その結果、物議を醸す。ここでは、ポリアクリルアミド、様々 な幹があり、人間の萌芽期の茎 (ES) の細胞を含む細胞、ひと誘導多能性幹 (iPS) 細胞が培養することができますに基づいていないゲルの準備のプロトコルについて述べる。架橋時間を変更することによって架橋度によって制御剛性不活性ポリビニル アルコール co イタコン酸 (P IA) から可変剛性を有するゲルを調製されました。幹細胞培養と分化のため将来のプラットフォームとして移植細胞外マトリックス由来オリゴペプチドと P IA ヒドロゲルを調べた。文化および羊水幹細胞、脂肪由来幹細胞、ヒト ES 細胞、ヒト iPS 細胞の通路は、ここで詳細に記述されます。オリゴペプチド P IA ヒドロゲルの剛性特性によって誘導された優れた性能を示した。このプロトコルは、生体材料、剛性特性と最後に、xeno フリー培養条件を用いた幹細胞の運命への影響を制御すると共に、彼らの表面操作の合成を報告します。最近の研究に基づく、そのような変更された基板として使用できます将来のプラットフォームをサポートし、異なるリンケージ; さまざまな幹細胞ラインの運命を指示さらに、再生成し、失われた臓器や組織の機能を回復します。
Introduction
阻害剤、成長因子によって調節される細胞、幹細胞、特にひと誘導多能性 (iPS) 細胞と人間の萌芽期の茎 (ES) 細胞の長期的な増殖の特定の血統に幹細胞の分化の運命は知られていると/または文化メディアの生理活性分子が小さく。最近では、生体材料、特に細胞文化生体材料の剛性の物理的な手がかりは、幹細胞の増殖と分化1,の2、運命を導く重要な要素に認識されています。 3,4,5,6。したがって、いくつかの研究は、主にさまざまな剛性を有するポリアクリルアミド ゲルを使用して分化、ゲル上培養した幹細胞の運命を調査し始めています。
焦点接着斑、細胞の形態、細胞表現型、および幹細胞接着、二次元 (2 D) 栽培1,2,3,5で特に生体材料の剛性を制御できます。幹細胞による生体微粒子のメカノ センサーは、焦点接着インテグリン受容体を介したシグナル伝達によって一般に制御されます。NMMIIA、非ミオシンのアクチン細胞骨格の IIA 依存性収縮は 2 D セル栽培システム3,4,5,における幹細胞の力覚機構プロセスで重要な役割を果たしている7,8,9,10,11。
エングラーおよび彼の同僚は骨髄幹 (BMS) 細胞特定のティッシュのような剛性を有する細胞培養材料の栽培など、成人の幹細胞に由来する細胞に分化する傾向にある興味深い概念を開発しました。特定のティッシュの5。BMS セル拡張メディア (脳組織に匹敵する剛性) と私は自発的に BMS 細胞に対し初期の神経系統に分化誘導された型コラーゲンでコーティングされた 2 D ソフト ポリアクリルアミド ゲル上培養筋肉や骨の膠原線維組織のような剛性を有するゲルは、2 D ポリアクリルアミド ゲル3、5、それぞれの筋細胞と骨芽細胞の初期に分化を誘導するために発見されました。多くの研究者は、分化の幹細胞の運命を調査したポリアクリルアミドの培養コラーゲン固定化ヒドロゲル I 型12,13,14,,1516,17,18,19,20,21しますただし、これは1、、いくつかの矛盾を報告に言及する必要があります18,22,23,24エングラーによって提案されたよく知られているアイデアの存在。ら5これは、エングラーのアイデア5ポリアクリルアミド ゲル上だけ開発された、生体材料 (ポリアクリルアミド) の特定の特性との物理的なキュー (剛性) からだけではなく、その結果が由来しています。生体材料。したがって、ハイドロゲルが剛性、ゲルの架橋によって制御することができます別の種類を開発することが重要です。この目的のため不活性ヒドロゲルは開発された異なる硬度の変化する架橋時間25、架橋度によって制御されたポリビニル アルコール co イタコン酸 (P IA) からを作製26,27,28,29,30,31,32. nonmodified P IA ゲルだけでなく、細胞外マトリックス (Ecm) とオリゴペプチド接木 P IA ヒドロゲル幹細胞を栽培できます。以前の研究25ひと造血幹細胞 (hHSCs) 臍帯血からが P IA ゲル上 3 kPa からフィブロネクチンやオリゴペプチドが由来 30 kPa 貯蔵弾性率の異なる剛性値で栽培しました。フィブロネクチン (CS1, EILDVPST) は P IA ヒドロゲルへ移植されました。HHSCs の倍拡大高前のヴィヴォは CS1 と 30 kPa2512 kPa に至る中間剛性を表示, フィブロネクチン, 接ぎ木 P IA ヒドロゲルで観察されました。
ヒト ES および iPS 細胞はビトロネクチンなどラミニンの多能性を維持するために、Ecm に特定のバインディングを必要とするため、ヒト iPS や ES 細胞を従来の培養ポリスチレン (TCP) 料理33,34を栽培することが長期間培養します。したがって、最適な剛性特性を持つ P IA ヒドロゲルをオリゴペプチド接木のいくつかの構造が設計され、単一のチェーン、ジョイント部分を持つ単一のチェーン、共同セグメントと分岐型デュアル チェーンの形成の準備チェーン32。オリゴペプチドのシーケンスは、Ecm のインテグリンとグリコサミノグリカン結合ドメインから選ばれました。約 25 kPa で貯蔵弾性率を持ち、デュアル チェーンまたは共同セグメント ビトロネクチン由来のオリゴペプチドをグラフトした P IA ヒドロゲルは xeno 無料と化学の下以上 12 通路をヒト ES および iPS 細胞の長期培養をサポート定義された条件32。共同セグメントとデュアル チェーン、ゲル上の細胞接着分子で容易に増殖し、ヒト ES および iPS の多能性細胞32。ここでは、(空気中の湿潤条件下で測定した 30 kpa の空気に 10 kPa からストレージ係数) と P IA ゲルの準備のプロトコル移植オリゴペプチドとまたは Ecm の説明。文化および (羊水幹細胞、脂肪由来幹細胞、ヒト ES 細胞、ヒト iPS 細胞を含む) いくつかの幹細胞を通過する方法が表示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト ES および iPS 細胞人間 AFS セル、広告細胞の培養のためだけでなく、無料の xeno の条件で 10 以上の通路を多能性を維持する長期的な拡大のため P IA oligoECM と可変剛性を有する P IA ECM ハイドロゲルを開発しました。そして造血幹細胞25,28,32。OligoECM で固定 P IA ヒドロゲルは分化の運命と様々 な種類の幹細胞として初代?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は科学技術、台湾省で許可番号 106-2119-M-008-003、105-2119-M-008-006 と 104-2221-E-008-107-MY3 の下で部分的に支持されました。本研究は、台湾 Landseed 病院プロジェクト (NCU LSH 105 A-001-) によっても支えられました。費補助金科学研究 (番号 15 K 06591) 教育省、文化、スポーツ、科学および技術の日本からも認められています。樋口は、大学院教育と研究、キング サウド大学 11451、サウジアラビア王国リヤドの国際科学のパートナーシップ プログラム (ISPP-0062) 副牧師の地位の確認したいと思います。
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Riferimenti
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