Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre
Summary
Um protocolo é apresentado para preparar polivinil álcool-co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes, que foram enxertados com e sem oligopeptídeos, para investigar o efeito da rigidez dos biomateriais na diferenciação e proliferação de células-tronco. A rigidez do hidrogel era controlada pelo tempo de reticulação.
Abstract
O efeito de sinais físicos, como a rigidez dos biomateriais de proliferação e diferenciação de células-tronco, foi investigado por vários pesquisadores. No entanto, a maioria destes investigadores utilizaram hidrogel de poliacrilamida para cultura de células-tronco em seus estudos. Portanto, seus resultados são controversos, porque esses resultados podem originar as especificidades da poliacrilamida e não do sinal físico (rigidez) dos biomateriais. Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de hidrogel, que não é baseados em poliacrilamida, onde vários tronco, células, incluindo células-tronco embrionárias humanas (ES) e humanas pluripotentes induzidas (iPS) células, podem ser cultivadas. Hidrogel com rigidez diferentes foram preparados a partir bioinert polivinil álcool-co-itacónico ácido (P-IA), com rigidez controlada pelo grau de reticulação, alterando o tempo de reticulação. O hidrogel de P-IA enxertado com e sem oligopeptídeos derivados de matriz extracelular foram investigados como uma futura plataforma para cultura de células-tronco e diferenciação. A cultura e a passagem de células tronco de líquido amniótico, células-tronco derivadas adiposo, células ES humanas e células iPS humana é descrito em detalhes aqui. O hidrogel de oligopeptídeos P-IA mostrou performances superiores, que foram induzidas por suas propriedades de rigidez. Este protocolo informa a síntese do biomaterial, sua manipulação de superfície, juntamente com controlar as propriedades de rigidez e, finalmente, seu impacto sobre o destino de células-tronco usando as condições de cultura xeno-livre. Com base em estudos recentes, tais substratos modificados podem atuar como futuras plataformas para apoiar e dirigir o destino de linha de células-tronco vários elos diferentes; e mais, regenerar e restaurar as funções do tecido ou órgão perdido.
Introduction
O destino da diferenciação de células-tronco em uma linhagem específica de células e a longo prazo proliferação de células-tronco, células especialmente humano pluripotentes induzidas (iPS) e células-tronco embrionárias humanas (ES), é conhecido por ser reguladas por inibidores, fatores de crescimento, e / ou pequenas moléculas bioativas em meios de cultura. Recentemente, as pistas físicas dos biomateriais, particularmente a rigidez dos biomateriais de cultura de células, têm sido reconhecidas para ser um importante fator para orientar o destino das células-tronco proliferação e diferenciação1,2, 3,4,5,6. Portanto, vários pesquisadores começaram a investigar o destino das células-tronco, que são cultivadas em hidrogel, na diferenciação, principalmente usando hidrogel de poliacrilamida com variação de rigidez.
A rigidez dos biomateriais pode controlar aderências focais, morfologia celular, fenótipo celular e adesão de células-tronco, especialmente em duas dimensões (2D) cultivo1,2,3,5. Mechano-detecção de biomateriais por células-tronco é geralmente controlada pela adesão focal sinalização via receptores integrinas. NMMIIA, miosina nonmuscle contratilidade IIA-dependente do citoesqueleto de actina desempenha um papel crítico no processo de mechanosensing das células-tronco em 2-D célula cultivo sistemas3,4,5, 7,8,9,10,11.
Engler e seus colegas desenvolveram uma noção interessante que células-tronco adultas, como as células-tronco (BMS) medula óssea cultivadas em biomateriais de cultura de células com uma rigidez semelhante ao de tecidos específicos, tendem a se diferenciar em células originadas-se tecidos específicos5. Células BMS incubadas em hidrogel de poliacrilamida macio 2-D, revestido com colágeno tipo I (com uma rigidez comparável de tecidos cerebrais) em meios de expansão foram induzidas espontaneamente para diferenciar em linhagens de neurônio precoce, Considerando que as células BMS cultivadas na Hidrogel com uma rigidez semelhante do músculo ou tecidos ósseos colágenas foram encontrados para induzir a diferenciação em linhagens iniciais de miócitos e osteoblastos, respectivamente, em hidrogel de poliacrilamida de 2-D3,5. Muitos pesquisadores têm investigado o destino de células-tronco de diferenciação cultivadas na poliacrilamida hidrogel imobilizada com colágeno tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. no entanto, deve-se mencionar que alguns contraditório relatórios1,18,22,23,24 existem para a conhecida ideia sugerida por Engler et al. 5 é porque ideia5 do Engler foi desenvolvido exclusivamente em hidrogel de poliacrilamida e seus resultados têm originado de características específicas do biomaterial (poliacrilamida) e não unicamente do cue físico (rigidez) de o biomaterial. Portanto, é importante desenvolver um outro tipo de hidrogel, dos quais a rigidez pode ser controlada por reticulação do hidrogel. Para este efeito, foram desenvolvidas bioinert hidrogel, que foram preparados de polivinil álcool-co-itacónico ácido (P-IA), com uma rigidez diferente, que foi controlada pelo grau de reticulação com uma mudança reticulação tempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. as células-tronco podem ser cultivadas em hidrogel de P-IA nonmodified, bem como P-IA hidrogel enxertado com matrizes extracelulares (ECMs) e oligopeptídeos. Em um estudo anterior25, hematopoiéticas células estaminais humanas (hHSCs) do sangue do cordão umbilical foram cultivadas sobre P-IA hidrogel com valores de rigidez diferentes que variam de um kPa 3 módulo de armazenamento 30 kPa onde fibronectina ou um oligopeptídeos derivados fibronectina (CS1, EILDVPST) foi enxertada o hidrogel P-IA. Alta ex vivo expansão dobra de hHSCs foi observada no hidrogel P-IA enxertado com CS1 ou fibronectina, que exibido um intermediário rigidez variando de 12 kPa a 30 kPa25.
IPS de humana e células ES não podem ser cultivadas na cultura de tecidos convencionais poliestireno (TCP) pratos33,34 porque ES humano e células iPS requerem ligação específica para ECMs, tais como vitronectina ou laminina para manter sua pluripotência durante a cultura a longo prazo. Portanto, várias estruturas de oligopeptídeos-enxertados P-IA hidrogel com características de rigidez ideal foram projetadas e preparadas em formações de uma cadeia única, uma única cadeia com um segmento comum, uma cadeia dupla com um segmento comum e um tipo ramificado Cadeia de32. Oligopeptídeos sequências foram selecionadas entre domínios de integrina e glicosaminoglicano-vinculação de ECMs. O hidrogel de P-IA enxertado com oligopeptídeos derivados vitronectina com uma dupla cadeia ou segmento comum, que tem um módulo de armazenamento em aproximadamente 25 kPa, com suporte a cultura a longo prazo do ES humano e células iPS para mais de 12 passagens sob livre de xeno e química condições definidas32. O segmento comum e corrente dupla com moléculas de adesão celular sobre o hidrogel facilitaram a proliferação e células de pluripotência humana ES e iPS32. Aqui, um protocolo para a preparação de P-IA hidrogel (com um módulo de armazenamento de 10 kPa a 30 kPa, que foi medido sob condições de chuva no ar) enxertadas com e sem oligopeptídeos ou ECMs é descrito. Como a cultura e a passagem de várias células-tronco (incluindo células tronco de líquido amniótico, células-tronco derivadas adiposo, células ES humanas e células iPS de humanos) é mostrado.
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-oligoECM e P-IA-ECM hidrogel com rigidez diferentes foram desenvolvidos para a expansão a longo prazo do ES humano e células iPS, mantendo sua pluripotência para mais de dez passagens em condições xeno-livre, bem como para a cultura de células humanas de AFS, células de anúncios, e células-tronco hematopoiéticas25,28,32. P-IA hidrogel imobilizada com oligoECM é um excelente candidato para materiais de cultivo cel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi parcialmente apoiada pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan sob concessão números 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 e 104-2221-E-008-107-MY3. Esta pesquisa foi também apoiada pelo projecto Hospital Landseed de Taiwan (NCU-LSH-105-A-001). Um subsídio para investigação científica (número 15K 06591) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão também é reconhecido. R. Higuchi gostaria de reconhecer para o programa de parceria científica internacional (ISPP-0062) Vice reitoria de pós-graduação e pesquisa, King Saud University, Riyadh 11451, Reino da Arábia Saudita.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Riferimenti
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
- Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
- Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
- Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
- Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
- Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
- Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
- Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
- Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
- Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
- Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
- Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
- Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
- Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
- Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
- Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
- Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
- Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
- Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
- Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).
