Summary
Denna artikel beskriver en metod att analysera immunceller innehåll av fettvävnad genom isolering av immunceller från fettvävnad och efterföljande analys med flödescytometri.
Abstract
Infiltration av immunceller i subkutan och visceral fettvävnad (AT) insättningar leder till en låggradig inflammation som bidrar till utvecklingen av fetma-relaterade komplikationer såsom typ 2-diabetes. För att kvantitativt och kvalitativt undersöka immunceller delmängder i mänskliga på insättningar, har vi utvecklat ett flöde flödescytometri tillvägagångssätt. Stromaceller vaskulär fraktionen (SVF), som innehåller de immuna cellerna, är isolerad från underhudsfett och visceralt på biopsier av kollagenas matsmältning. Adipocyter avlägsnas efter centrifugering. SVF cellerna färgas för flera membran-bundna markörer valt att skilja mellan immunceller delmängder och analyseras med flödescytometri. Till följd av detta synsätt, pro - och anti - Anti-Inflammatory makrofag delmängder, dendritiska celler (DCs), B-celler, CD4+ och CD8+ T-celler och NK-celler kan identifieras och kvantifieras. Denna metod ger detaljerad information om immunceller i AT och beloppet för varje specifik delmängd. Eftersom det finns många fluorescerande antikroppar finns, kan vårt flöde flödescytometri tillvägagångssätt justeras för att mäta olika andra cellulära och intracellulära markörer av intresse.
Introduction
Fetma kännetecknas med låggradig AT inflammation1 och infiltration av pro-inflammatoriska immunceller i både visceral och subkutant på (moms, satt). Ansamling av pro-inflammatoriska immunceller i mervärdesskatt leder till insulinresistens vilket är en primär riskfaktor för att utveckla typ 2-diabetes2. Immuna celler av både medfödd och adaptiv immunförsvaret finns i feta AT, såsom makrofager, mastceller, neutrofiler, CD4+ och CD8+ T-celler och B-celler3,4,5,6 ,7. Dessa immunceller, tillsammans med endotelceller, stromaceller, fettceller stamfäder, fibroblaster och pericyter, utgör den SVF8 och är den huvudsakliga källan av pro-inflammatoriska ämnen i AT9.
VID inflammatoriska status utreds vanligen av tekniker inklusive Western blot10, qPCR11och immunohistokemi11. När du använder dessa tekniker, hela AT, adipocyter och SVF, används dock. Detta gör det svårt att avgöra mängden och delmängder av immunceller i AT. Immunceller har olika cell markörer att definiera och kategorisera dem, såsom makrofager. Makrofager visar betydande heterogenitet i både funktion och cell surface markör uttryck12. Därför är de ofta kategoriseras i två makrofag populationer: M1 och M2. M2 makrofager kallas brukar alternativt aktiverade makrofager12,13 och bor i AT lean, metaboliskt normala människor14. Men under fetma uppstår en fenotypisk switch från M2 makrofager till M1 makrofager. Dessa aktiveras klassiskt M1 makrofager express CD11C12 och ackumuleras runt döda fettceller att bilda kronan-liknande strukturer13. Det har visats att CD11C+ makrofager i AT försämra insulinets verkan och är associerade med insulinresistens i feta människor15. För att identifiera M1 och M2 makrofager i AT, är immunohistokemi ett alternativ. Denna teknik ger information om placeringen av makrofager i vävnaden. Dock begränsas antalet markörer som kan användas i en färgning. Dessutom är det också svårt att kvantifiera. Därför, för att undersöka olika immunceller delmängder i moms och lör insättningar, har vi utvecklat ett flöde flödescytometri tillvägagångssätt. Detta tillvägagångssätt ger oss möjlighet att använda flera markörer per cell med en Flödesanalys flödescytometri att definiera cell delmängder och räkna antalet varje delmängd i AT insättningar.
Protocol
Naturliga och subkutant på prover tagna på patienter inskrivna i studien godkänts av medicinsk etisk kommitté Jessa sjukhus, Hasselt och Hasselt universitetet, Belgien, i enlighet med Helsingforsdeklarationen.
1. beredning av reagens
- Kollagenas lösning
- Lös upp 1 g av kollagenas jag i 10 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS, utan kalcium och magnesium) för att göra en 100 mg/mL stamlösning. Förbereda 200 µL portioner och förvaras vid-20 ° C.
- Lös upp 1 g av kollagenas XI i 10 mL PBS att göra 100 mg/mL stamlösning. Förbereda 200 µL portioner och förvaras vid-20 ° C.
- Lös 10 mg DNAS jag i 10 mL PBS att göra 10 mg/mL stamlösning. Förbereda 180 µL portioner och förvaras vid-20 ° C.
- Tillsätt 100 µL kollagenas I (100 mg/mL), 100 µL kollagenas XI (100 mg/mL) och 90 µL DNAS I (10 mg/mL) till 10 mL DMEM Hams F12. Gör kollagenas lösning färska för varje isolering.
- Erytrocyt lyseringsbuffert
- Lös upp 0,84 g NH4Cl i 100 mL av ultrarent vatten.
- Ange pH 7,4 före användning. Lagra i en glas-kolv vid 4 ° C.
- Placera den erytrocyt lyseringsbuffert på is före användning.
- FACS buffert
- Lös 0,5 g bovint serumalbumin (BSA) i 100 mL PBS att få 0,5% BSA PBS.
- Lös 65 mg NaN3 i 100 mL 0,5% BSA PBS att erhålla 10 mM NaN3 0,5% BSA PBS. Förvara lösningen i en glas-kolv vid 4 ° C.
- Plats FACS buffert på is före användning.
FÖRSIKTIGHET: NaN3 är mycket giftiga. Arbeta i dragskåp och bära skyddsglasögon och handskar för skydd vid hantering av NaN3.
- Humant IgG block
- Lös 10 mg humant IgG i 10 mL PBS att erhålla 1 mg/mL. Förbereda 100 µL portioner och förvaras vid-20 ° C.
- Placera det mänskliga IgG-blocket på is före användning.
2. isolering av SVF från AT
- Skär 1 g vid biopsi i små bitar (± 2 mm2) med en skalpell och överför till en 50 mL centrifugrör (t.ex., falconrör). Tillsätt 10 mL av kollagenas lösning till varje på provet.
Obs: Stäng locket på röret helt och vrid locket 1/4 varv tillbaka. - Inkubera i 60 minuter vid 37 ° C i ett vattenbad under milda skakningar (60 cykler/min).
- Filtrera den resulterande suspensionen med 200 µM filter och samla in provet i en ny 50 mL centrifugrör. Tillsätt 7 mL PBS ovanpå filtret att skölja filtret och få alla celler.
- Centrifugera provet vid 280 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort den flytande fraktionen fettceller genom pipettering. Cellpelleten är SVF.
Obs: Ta bort fettceller bråket för att erhålla SVF. Undvika att dränka hela spetsen i provet eftersom detta tar endast bort PBS och inte de flytande adipocyter. - Återsuspendera SVF i 5 mL PBS ta bort kollagenas, filtrera suspensionen med 70 µM filter, skölj filtret med 5 mL PBS och centrifugera provet vid 280 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 mL lyseringsbuffert erytrocyt.
- Inkubera i 5 min på is. Tillsätt 7 mL PBS efter inkubation.
- Centrifugera provet vid 280 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
3. färgning av SVF för flödescytometri Flödesanalys
- Lös upp cellpelleten i 90 µL 4 ° C FACS buffert och tillsätt 10 µL av 1 mg/mL humant IgG block. Dela cellsuspensionen i 2 brunnar 96 v-formen väl platta. Placera plattan på isen och låta humant IgG blocket Inkubera i 15 min.
- Tillsätt 100 µL FACS buffert till varje prov att tvätta och centrifugera plattan för 5 min med 280 x g vid 4 ° C. Ta bort supernatanten genom att tippa plattan uppochner i en jämn rörelse utan att trycka plattan.
Obs: Se till att ta bort eventuella kvarvarande vätska från toppen av plattan med en vävnad medan hålla plattan uppochner. - Förbereda antikropp cocktails makrofag och DC undergrupper (FACS panel 1) och för T - och B-cell undergrupper (FACS panel 2) som beskrivs i tabell 1 och tabell 2. De volymer som beskrivs i tabell 1 och tabell 2 väljs efter optimera antikropp koncentrationerna och räcker för en moms eller lör provet.
Obs: FACS på panelen 1 använda markörerna CD303 och CD141 för att bekräfta att CD11C+ CD11Blåg celler är DCs. Det rekommenderas dock att utesluta dessa markörer från panelen att inkludera en live/dead färgning. Båda FACS panel 1 och 2 kan kombineras med LIVE/DEAD fastställbara Red Dead Cell Stain Kit livskraft färgning när exklusive CD303 i panel 1 som PE kanal kommer att vara oanvända. Utföra livskraft färgning enligt tillverkarens anvisningar. - Återsuspendera pelleten i 29,5 µL antikroppar cocktail för FACS panel 1 och 23 µL antikroppar cocktail för FACS panel 2. Inkubera i 30 min i mörker på is.
- Tillsätt 150 µL FACS buffert till varje brunn och återsuspendera cellpelleten för att utföra en andra TVÄTTNINGSSTEGET. Centrifugera plattan för 5 min vid 280 x g och 4 ° C. Ta bort supernatanten genom att tippa plattan uppochner.
- Tillsätt 150 µL 1% formaldehydlösning till varje brunn fixar cellerna. Överföra cellsuspensionen från varje brunn till motsvarande FACS röret genom pipettering med P200 pipett. Lagra FACS rören vid 4 ° C i mörker på upp till 7 dagar.
Obs: Det går även att direkt mätning. Tillsätt 150 µL FACS buffert till varje brunn i stället för 1% formaldehyd, överföra cellerna genom pipettering med P200 pipett till motsvarande FACS rören och analysera cellerna.
Varning: Formaldehyd är mycket giftigt. Förbereda formaldehyd lösningar medan du arbetar i ett dragskåp att undvika inandning och Använd skyddshandskar och skyddsglasögon för skydd.
4. Flödesanalys flödescytometri
- Innan den första mätningen, Använd en ofärgade negativ kontroll för att ställa fram scatter (FSC) och side scatter (SSC). Justera spänningarna av en flödescytometer enligt tillverkarens anvisningar så att alla populationer av intresse syns i figuren FSC och SSC och kan göras en åtskillnad mellan skräp och levande celler.
- Utföra flerfärgade ersättning analys med antikroppar tillfångatagandet pärlor efter tillverkarens protokollet.
- Förbereda fluorescens minus en (FMO) kontroller genom att antikroppar mixen men utesluta en antikropp från mixen. Gör detta för varje antikropp, skapa 8 antikropp mixar för FACS panel 1 och 6 antikropp mixar för FACS panel 2. Dessa FMO antikropp blandningar används för att färga SVF som beskrivs tidigare i detta protokoll.
- Mäta alla FMO kontroller och ange den portande strategi baserad på FMO kontroller. Använda FMO kontrollerna för att upptäcka möjliga auto-fluorescens av cellerna.
Obs: Genom att ta bort en antikropp från mixen, någon fluorescens nivå upptäckt i denna kanal är en bakgrund/autofluorescent signal. Därför, genom att jämföra de olika FMO kontroll FACS resultat, grindar kan ritas på specifika populationer att gatings är baserat på positiva celler och inte baserat på auto-fluorescens. - Cyklontuber FACS vid 800 rpm innan du placerar dem i en flödescytometer och starta mätningen.
Obs: Minst 50.000 evenemang i utfärda utegångsförbud för levande rekommenderas att säkerställa tillräckligt med celler mäts från varje delpopulation.
Representative Results
Den SVF isolerade från moms och satt mättes med flödescytometri. Flödescytometri Flödesmätningarna generera tomter visar olika cellpopulationer baserat på cellulära markörer (figur 1A och 1B). Först framåt genom att rita scatter bredd (FSC-W) och vidarebefordra scatter område (FSC-A), cell aggregat kan elimineras från ytterligare analys av gating de enstaka cellerna som låg FSC-W. Nästa, levande celler är markerade och cellulära skräp är uteslutet av gating cellerna i rätt storlek och komplexitet som använder FSC-en och side scatter område (SSC-A), respektive. Döda celler är små och därför synliga som en distinkt population med en liten FSC-A. Nästa, immunsystemet celler valdes genom användning av pan-leukocyt markören CD45 (Panel 1 och 2, figur 1A). För att analysera makrofager, andra immuna celler såsom T-celler (CD3), B-celler (CD19), neutrofiler (CD66b+ CD11b+), och NK-celler (CD56) exkluderades från ytterligare analys med hjälp av olika antikroppar riktade dessa celler, men med samma fluorokrom. Ytterligare underuppdelning av återstående cellerna baserades på CD11b och CD11c uttryck. Detta resulterade i följande populationer: CD11b+ CD11c+ makrofager, CD11b+ CD11c– makrofager och CD11blåg /- CD11c+ DCs (FACS panel 1, figur 1B). Mätning av genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) tillåtet kvantifiering av uttrycket av CD303 (dess DC markör) och CD141 (DC markör), på CD11b+ CD11c+ makrofager och CD11blåg /- CD11c+ DCs. Uttryck för båda dessa markörer var högre i CD11blåg /- CD11c+ celler bekräftar att CD11blåg /- CD11c+ celler var DCs (figur 1 c).
CD45+ celler (figur 1A) delades in i T-celler och B-celler med CD3 och CD19, respektive. T-celler var indelad i T-hjälpare celler (CD4+) och cytotoxiska T-celler (CD8+). Slutligen, CD3–CD19–celler var ritade att kvantifiera NK-celler med märkpenna CD56 (FACS panel 2, figur 1 d). Antalet celler i varje gate kvantifieras och kan användas för att beräkna procentandelen av denna celltyp i alla levande celler (tabell 3).
Procentandelen av levande celler kan beräknas för varje ämne som möjliggör beräkning av ett genomsnitt av alla ämnen i en grupp till exempel magert eller överviktiga män visar överflödet av en specifik immun cell, dvs., den pro-inflammatoriska CD11b+ CD11c+ makrofager i visceral AT (figur 2).
Figur 1. FACS gating strategi av visceral fettvävnad. (A), FACS handlingen i alla händelser (svart) med framåt scatter bredd intensitet (FSC-W) och framåt scatter området intensitet (FSC-A) som innehåller en grind för att markera endast enstaka celler (röd) följt av en FACS tomt baserat på FSC-A och side scatter området intensitet (SSC-A) innehållande en grind att välja levande celler (ljusgrön). Nästa tomt med SSC-A och CD45 fluorescensintensiteten innehåller en utfärda utegångsförbud för att välja alla CD45+ (immun) celler (blå). (B), FACS tomt CD19, CD3, CD66b och CD56 fluorescensintensiteten kontra CD11b fluorescensintensiteten och en grind som att markera alla celler som är CD19, CD3, CD66b och CD56 negativa (brun) för ytterligare uppdelning i populationer. Ytterligare indelning i nästa tomten baserat på CD11b och CD11c fluorescensintensiteten. Gates visas som innehåller CD11b+ CD11c+ makrofager (Mörkgrön), CD11b+ CD11c– makrofager (lila) och CD11blåg /- CD11c+ dendritiska celler (blå). (C) beloppet av CD11b+, CD11c+, eller CD11blåg /- CD11c+ celler (y-axeln) visar deras nivåer av fluorescensintensiteten (x-axeln) för CD303 och CD141, och motsvarande kvantifiering av medelvärdet fluorescensintensiteten (MFI). (D), FACS tomt visar den föregående CD45+ befolkningen (blå) baserat på CD3 och CD19 fluorescensintensiteten som innehåller gates att välja T-celler (magenta), B-celler (Mörkgrön) och icke-autofluorescent celler (grön) negativt för båda CD3 och CD19. Följande handlingen är baserad på CD4 och CD8 fluorescens med grindar att välja CD4+ (ljusgrön) och CD8+ (magenta) T-celler. En identisk Usenets strategi används för subkutan fettvävnad. En identisk Usenets strategi används för subkutan fettvävnad. Denna siffra har ändrats från Wouters m.fl. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Feta moms innehåller mer pro-inflammatoriska makrofager. Mängden CD11b+ CD11c+ makrofager presenteras som procent av alla levande celler i mervärdesskatt för lean och feta män. Alla data är medel ± SEM; n = 20 för lean och n = 31 för överviktiga. p ≤ 0,01 vs lean. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mål | Definition mål | Presentera på | Fluorokrom | Kvantitet | Klon |
| CD11B | myeloisk integrin markör | granulocyter, monocyter/makrofager, dendritiska cellerlåg och naturliga mördarceller | BV421 | 2,5 ΜL | ICRF44 |
| CD19 | gemensamma B cells antigen | B-cell utveckling från pro-B-cellen till blastoid B cell och plasma B cell | FITC | 3 ΜL | HIB19 |
| CD3 | vanliga T cells antigen | T-lymfocyter, naturliga mördareT-celler och tymocyter | FITC | 3 ΜL | UCHT1 |
| CD66B | medlem av carcinoembryonalt antigen (CEA)-lik glykoprotein familj | granulocyter | FITC | 5 ΜL | G10F5 |
| CD56 | tungt glykosylerat vidhäftning protein | naturliga mördarceller och naturliga mördareT-celler | FITC | 5 ΜL | B159 |
| CD303 | typ II transmembrana glykoprotein | dess dendritiska celler | PE | 1 ΜL | 201A |
| CD141 | thrombomodulin | monocyter/makrofagerlåg, subpopulationen av dendritiska celler | APC | 1 ΜL | M80 |
| CD11C | typ I transmembrana glykoprotein; integrin αx | dendritiska celler, naturliga mördarceller, granulocyter, monocyter/makrofager, delmängd av T och B celler | APC-Cy7 | 0,5 ΜL | Bu15 |
| CD45 | gemensamma leukocytantigen | alla humana leukocyter inklusive lymfocyter, monocyter, granulocyter, eosinofiler och tymocyter | PE-Cy7 | 1 ΜL | HI30 |
| FACS buffert | - | - | - | 7.5 µl | - |
Tabell 1. Antikroppar cocktail för FACS panel 1 att identifiera makrofag underdelar och dendritiska celler populationer. Mängden antikroppar som beskrivs är för analys av ett prov.
| Mål | Definition mål | Presentera på | Fluorokrom | Kvantitet | Klon |
| CD19 | gemensamma B cells antigen | B-cell utveckling från pro-B-cellen till blastoid B cell och plasma B cell | BV421 | 1 ΜL | HIB19 |
| CD3 | vanliga T cells antigen | T-lymfocyter, naturliga mördareT-celler och tymocyter | V500 | 3 ΜL | UCHT1 |
| CD56 | tungt glykosylerat vidhäftning protein | naturliga mördarceller och naturliga mördareT-celler | APC | 5 ΜL | HCD56 |
| CD4 | Ig superfamiljen, typ I transmembrana glykoprotein | T helper cells, tymocyter, monocyter/makrofager, typ II naturliga mördareT-celler | PerCP-Cy5.5 | 1 ΜL | RPA-T4 |
| CD8 | Α-subenheten av ett disulfid-länkade bimolecular komplex | cytotoxiska T-celler, tymocyter, delmängd av naturliga mördarceller | APC-H7 | 2 ΜL | SK1 |
| CD45 | gemensamma leukocytantigen | alla humana leukocyter inklusive lymfocyter, monocyter, granulocyter, eosinofiler och tymocyter | PE-Cy7 | 1 ΜL | HI30 |
| FACS buffert | - | - | - | 10 µl | - |
Tabell 2. Antikroppar cocktail för FACS panel 2att identifiera T - och B-cells populationer. Mängden antikroppar som beskrivs är för analys av ett prov.
| Makrofag panel | ||
| Gate namn | # Celler | % av levande |
| Enstaka celler | 183054 | |
| Live | 10477 | 100 |
| CD45 | 4100 | 39.13 |
| dumpa– | 771 | 7,36 |
| CD11C– CD11B+ | 430 | 4.1 |
| CD11C+ CD11B+ | 104 | 0,99 |
| CD11C+ CD11Blåg /- | 15 | 0,14 |
| T-celler, B-celler, NK-cell panel | ||
| Gate namn | #Cells | % av levande |
| Enstaka celler | 34616 | |
| Live | 3728 | 100 |
| CD45+ | 1589 | 42.62 |
| NK-celler | 29 | 0,78 |
| CD3+ | 953 | 25,56 |
| CD4+ | 601 | 16.12 |
| CD8+ | 328 | 8,8 |
| CD19+ | 20 | 0,54 |
Tabell 3. Immunceller överflöd av olika celltyper i moms. Antalet celler i varje gate och andelen av de olika celltyper baserat på den totala mängden levande celler.
Discussion
Dessa metoder beskriva hur man isolera SVF från mervärdesskatt och satt och kvantifiera de relativa mängder immunceller inom dessa vävnader. Dessutom ange metoderna så avgör uttrycket av markörer på specifika celltyper.
Flödescytometri av vävnad immunceller är en kraftfull teknik till fenotypen vävnader immunologiska tillstånd. Kvantifiering av vävnad immunceller kan ha många program. Som beskrivs i resultatet, är det möjligt att jämföra förekomsten av specifika immunceller mellan patientgrupper (t.ex., lean vs. överviktiga). Dessutom, genom att också utföra flödescytometri på blod av samma patienter, kan associationer mellan cirkulerande celler och vävnadsceller undersökas. Med det här programmet kunde vi fastställa att en viss delmängd av cirkulerande monocyter är associerade med pro-inflammatoriska CD11C+ adipose vävnad makrofager16.
Justeringar av beskrivna protokollet kommer att utöka dess tillämpningar som många tillgängliga fluorescerande antikroppar gör flödescytometri mycket mångsidig. Med olika antikroppar nästan alla celltyper kan urskiljas och uttrycket av många markörer kan upptäckas. Dessutom är det möjligt att färga markörer intracellulärt av permeabilizing cellmembranet för att tillåta intracellulära bindning av fluorescerande antikroppar. Dessa egenskaper gör det möjligt för skillnaden av de mycket varierande makrofag populationerna bortom de alltför förenklad M1 och M2 makrofag undertyperna. Förutom mätning av surface markör uttryck, kan proteiner (dvs, cytokiner) färgas intracellulärt ger information om makrofag funktionalitet. Dessutom används spridning markörer såsom Ki67 att kvantifiera spridning priser. Som beskrivits, bygger åtskillnad mellan makrofager och DCs på MFI nivåer av DC markörer. En allmän makrofag markör, såsom CD68 kan införlivas i panelen makrofag (FACS panel 1). CD68 behöver dock färgas intracellulärt som kräver permeabilisering av cellmembranet som inte är att föredra och vill utöka protokollet. Andra makrofag markörer är delmängd markörer såsom CD163 och CD206 eller CD11c, den senare integreras i panelen makrofag presenteras här.
I våra FACS paneler, en markör för att skilja mellan levande och döda celler ingick inte, vilket skulle vara att föredra eftersom det ger en mer exakt uteslutning av döda celler än användning av FSC och SSC. Ofta används är DNA färgning livskraft färgämnen propidium jodid (PI) eller 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) samt fria aminen reagerar färgämnen som LIVE/DEAD fastställbara döda cellen Stain Kit, som finns i olika färg färger. PI och DAPI inte kan dock användas vid fastställande av cellerna. Som beskrivs i protokollet, kan LIVE/DEAD fastställbara Red Dead Cell livskraft färgningen integreras i både paneler utan att det påverkar den övergripande FACS gating strategi.
Dessutom uttrycks data som en procentandel av levande celler vilket innebär att alla data är relativa. Endast genom att ange en exakt, skulle känt antal celler i i flödescytometer, det vara möjligt att fastställa det exakta antalet varje celltyp. Ett ungefärligt antal celler kunde beräknas efter räknar cellerna i SVF fraktionen med hjälp av en räknande kammare. Detta antal skulle behöva justeras för biopsi vävnad används för att isolera SVF, men detta har begränsningar när man jämför lean till överviktiga på. En liknande massa feta AT består av mindre adipocyter eftersom de är fyllda med lipider och har expanderat kraftigt. Detta kan leda till en underskattning av immunceller nummer om presenteras som antalet immunceller per gram på eller fettceller.
I humanstudier görs inklusion av patienterna vanligen under en längre tid att göra standardisering av experimentella rutiner av stor betydelse. För jämförelse av flödescytometri flödesdata mellan patienter finns det flera alternativ. Som beskrivs i detta protokoll, kan cellerna fastställas före mätningen möjliggör analys av flera prover på samma dag. Detta kan även uppnås genom att frysa SVF innan färgning dem, vilket gör den färgningsproceduren ska vara lika mellan alla prover, men lönsamheten för celler kan påverkas. Slutligen också anställd i denna studie, är fluorescerande pärlor att installera kompensationsnivåer och cytometer spårning pärlor användes varannan vecka för att standardisera dagliga mätningar av cytometer. Det sista alternativet är mest effektiv vid mätning av prover från en studie som spänner över en lång tidsperiod.
En begränsande faktor för flödescytometri är i allmänhet användningen av fluorescens. Antalet fluorescerande etiketter som kan identifieras samtidigt är begränsad på grund av överlappning i utsläpp spectra. Men med smart FACS panel utveckling och användning av flera antikropp cocktails per moms eller lör prov, kan problemet lösas som beskrivs i detta protokoll. En viktig aspekt av FACS panel utveckling är FMO kontroller. Med hjälp av alla antikroppar av panelen utom en, kan potentiella autofluorescens nivåer uppskattas när man jämför FMO med hela panelen. Detta tillåter korrekt gating av populationer och dessa bör utföras när du konfigurerar en ny FACS-panel. Nya generationer av FACS enheter kan dessutom upptäcka upp till 50 parametrar som möjliggör samtidig identifiering av många egenskaper per cell. En annan fråga som rör fluorescens aspekten är autofluorescens av celler, särskilt makrofager. Efter magnetisering av cellerna med FACS laser (främst med 488 nm våglängd excitation), dessa celler avger en fluorescerande signal (främst < 640 nm) att kan överlappning med utsläpp spektra av antikropp etiketter17,18. För att beakta detta, bör ofärgade celler mätas för att bestämma autofluorescens i varje kanal. Med denna kunskap bör det väljas fluorokromer som visar en signalstyrka som överskrider autofluorescent signalen. Denna autofluorescent bakgrund signal bör beaktas vid fastställandet av den portande strategin av befolkningarna. Därför, genom tillämpning av detta protokoll och intelligent FACS panel design är det möjligt att i djup fenotyp makrofag undertyper. Ny distinkt AT makrofager och deras funktion kan karakteriseras.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka J. van de gåår och M. Vroomen (universitetet i Maastricht, Nederländerna) för deras tekniska support. Dessutom vill vi tacka K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, och E. Blaak för att tillhandahålla de blod- och vävnadsprover biopsier används för att ställa in detta protokoll och de efterföljande experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
| Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
| Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
| NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
| 200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
| 70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
| Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
| Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
| CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
| CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
| CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
| CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
| CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
| CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
| CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
| CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
| CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
| CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
| CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
| CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
| CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
| FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
| 96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
| PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
| FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
| Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
| LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
| IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |
References
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines. ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).
- Han, J. M., Levings, M. K. Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation. J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).
- Koh, Y. J., et al. Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).
- Peinado, J. R., et al. The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots. Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).
- Leggate, M., et al. Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males. Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).
- Divoux, A., et al. Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).
- Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue. Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).
- Wentworth, J. M., et al. Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity. Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).
- Wouters, K., et al. Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue. Sci Rep. 7, 42665 (2017).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).
- Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
