Denne protokollen gjør leseren til å analysere galle salt-indusert biofilm formasjonen i enteric patogener med en mangefasettert tilnærming for å fange dynamikken i bakteriell biofilm ved å vurdere etterlevelse, ekstracellulære polymere stoff matrix formasjon, og spredning.
Biofilm formasjon er en dynamisk, flertrinns prosess som skjer i bakterier under harde forhold eller tider med stress. For enteric patogener, er en betydelig stressrespons indusert under gastrointestinal transport og galle eksponering, en normal del av menneskelige fordøyelse. For å overvinne bakteriedrepende effekten av galle, danne mange enteric patogener en biofilm hypotesen for å tillate overlevelse når transitt gjennom tynntarmen. Her presenterer vi metoder for å definere biofilm formasjon gjennom solid-fase tilslutning analyser samt ekstracellulære polymere stoff (EPS) matrix gjenkjenning og visualisering. Videre er biofilm spredning vurdering presentert for å etterligne analyse av hendelser utløse utgivelsen av bakterier under infeksjon prosessen. Crystal violet flekker brukes til å oppdage tilhenger bakterier i en høy gjennomstrømming 96-brønns plate overholdelse av analysen. EPS produksjon vurdering bestemmes av to analyser, nemlig mikroskopi farging av EPS matrise og semi kvantitativ analyse med en fluorescently-konjugerte polysakkarid bindende Lektiner. Endelig måles biofilm spredning gjennom kolonien teller og plating. Positive data fra flere analyser støtte karakterisering av biofilm og kan brukes til å identifisere galle salt-indusert biofilm formasjon i andre bakterielle stammer.
Biofilm dannelsen er en viktig bakteriell overlevelsesstrategi indusert under harde forhold. Eksponering for bakteriedrepende forbindelser som antibiotika eller endringer i næringsstoffer eller oksygen tilgjengelighet induserer en stresset stat i bakterier som kan lindres gjennom biofilm dannelsen. En biofilm er preget av bakteriell vedlegg til en overflate eller andre bakterier og ledsages av utskillelsen av en EPS matrise hovedsakelig består av polysakkarider1,2,3. Biofilm formasjon er en dynamisk prosess der en kaskade av hendelser kulminerer i dannelsen av en moden tilhenger bakterielle samfunnet1,2,3. Bakterien produserer adhesins for å lette tidlig vedlegg skifting av adhesin genet uttrykket profiler for å styrke vedlegg under biofilm modning. Samtidig, slår EPS produksjon strøk den bakterielle samfunnet i en matrise å beskytte cellene fra det første trykk. Bakterier i biofilm er langsom voksende; og som sådan, gjør de fleste antibiotika ineffektive. Videre sparer den langsomme veksten energi til forholdene endres til fordel bakterievekst1,2,3. Etter de harde forholdene har gått, bakterier spre biofilm og gjenoppta en planktoniske livsstil1,2,3. Tradisjonelt biofilm er observert på overflater og en vedvarende klinisk utfordring på grunn av smitte reservoarene på katetre og i-bolig enheter1,2,3.
Biofilm formasjon ble nylig beskrevet for flere enteric patogener; bakterier som smitter tynntarmen eller kolon4. For Shigella arter, oppstår infeksjon i menneskelig kolon etter transitt gjennom fleste gastrointestinaltraktus. Under passasje gjennom tynntarm, er Shigella utsatt for galle; en lipid-nedverdigende vaskemiddel utskilles i tarmen til rette for fordøyelsen av lipider mens samtidig drepe de fleste bakterier5. Innstigning patogener har en unik evne til å motstå bakteriedrepende effekten av galle6. Vår siste analyse benyttet i vivo-liker kombinasjoner av glukose og galle salter å demonstrere robuste biofilm formasjon i S. flexneri og andre arter av Shigella, sykdomsfremkallende Escherichia coliog Salmonella4. Tidligere Salmonella enterica serovar Typhi ble vist å danne en galle-indusert biofilm på grunn av unike kolonisering av gallbladder under kronisk infeksjon7,8,9, 10. i tillegg tidligere forskning med Vibrio11og12 vist biofilm formasjon svar galle. Derfor analysene utvidet galle-indusert biofilm formasjon observasjoner til andre patogener og bidra til å etablere demonstrasjon av bevarte enteric patogen svar til galle. I motsetning til kronisk biofilm som bakteriell genet transkripsjon er begrenset og celle senescence kan oppstå1,2,3, foreslår vi at enteric galle-indusert biofilm er mer midlertidig i naturen. Denne forbigående, virulente biofilm er stemplet av en rask demontering (som sett i spredning analysen) og forbedret virulens genuttrykk observert i biofilm befolkningen4,6.
Biofilm formasjon er en multifaceted, dynamisk prosess og bruk av galle salter som en initiering faktor har bare vært nylig beskrevet for mest enteric patogener, er verktøy og teknikker som brukes unike og kreative programmer av tradisjonelle metoder. Dermed er presenteres her tre gratis strategier for å kvantifisere flere viktige egenskaper av galle salt-indusert biofilm formasjon, inkludert bakteriell etterlevelse, produksjon av EPS matrix og spredning av levedyktig bakterier fra biofilm. Disse teknikkene har vært benyttet for forskning med Shigella; og derfor evaluering av andre enteric patogener kan kreve optimalisering. Likevel positive data fra alle tre analyser støtter identifikasjon av biofilm og etablere reproduserbar protokoller for galle salt-indusert biofilm formasjon.
Analyse av biofilm formasjon er utfordrende på grunn av dynamikken i biofilm og variasjonen mellom stammer, materialer, laboratorier og analyser. Her presenteres flere strategier for å fastslå biofilm formasjonen i enteric patogener etter galle salter eksponering med eksperimentelle innsikt forsynt for å fremme reproduserbarhet. Det er flere hensyn å sikre reproduserbarhet. Først og fremst, anbefales det at du utfører minst tre uavhengige eksperimenter med teknisk triplicates å bekrefte observasjoner og statistis…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Rachael B. Chanin og Alejandro Llanos-Chea for teknisk assistanse. Vi takker Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski og Bobby Cherayil for stammene som er brukt i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer Grant K22AI104755 (C.S.F.). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
96-well plate reader | Spectramax | ||
Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |