Galde Salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener: teknikker til identifikation og kvantificering
Summary
Denne protokol det muligt for læseren at analysere galde salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener ved hjælp af en mangefacetteret tilgang til at fange den dynamiske karakter af bakterielle biofilm ved vurderingen af overholdelse, ekstracellulære polymert stof matrix dannelse, og dispersion.
Abstract
Biofilmdannelse er en dynamisk, flertrins proces, der forekommer i bakterier under hårde miljømæssige forhold eller tider med stress. For enterisk patogener, er en betydelig stressrespons induceret under gastrointestinal transit og galde eksponering, en normal del af menneskers fordøjelse. For at overvinde de bakteriedræbende virkninger af galde, udgøre mange enteriske patogener en biofilm hypotese for at muliggøre overlevelse, når transit gennem tyndtarmen. Her præsenterer vi metoder for at definere Biofilmdannelse gennem solid-faset tilslutning assays samt ekstracellulære polymert stof (EPS) matrix påvisning og visualisering. Derudover præsenteres biofilm spredning vurdering for at efterligne analyse af begivenheder udløser frigivelse af bakterier under infektion oparbejde. Krystalviolet farvning bruges til at påvise vedhængende bakterier i en høj overførselshastighed 96-brønd plade overholdelse assay. EPS-produktion vurdering bestemmes af to assays, nemlig mikroskopi farvning af EPS-matrix og semi-kvantitative analyse med en fluorescently-konjugeret polysaccharid bindende lektin. Endelig måles biofilm spredning gennem koloni tæller og plating. Positive data fra flere assays støtte karakterisering af biofilm og kan udnyttes til at identificere galde salt-induceret Biofilmdannelse i andre bakterielle stammer.
Introduction
Biofilmdannelse er en vigtig bakteriel overlevelsesstrategi induceret under hårde miljømæssige forhold. Eksponering for bakteriedræbende stoffer som antibiotika eller ændringer i næringsstof eller ilt tilgængelighed inducerer en stresset tilstand i bakterier, der kan afhjælpes gennem Biofilmdannelse. En biofilm er karakteriseret ved bakteriel vedhæftet fil til en overflade eller andre bakterier og er ledsaget af udskillelsen af en EPS-matrix primært består af polysaccharider1,2,3. Biofilmdannelse er en dynamisk proces, hvor en kaskade af begivenheder kulminerer i dannelsen af en moden vedhængende bakteriel EF1,2,3. Bakterier producere adhesins for at fremme tidlig vedhæftet fil mens skiftende adhesin gen expression profiler for at styrke vedhæftet fil under biofilm modning. Samtidigt, sker EPS-produktion til pels bakteriel Fællesskabet i en matrix til at beskytte celler fra den oprindelige stressor. Bakterier findes i biofilm er langsomt voksende; og som sådan gør de fleste antibiotika ineffektive. Desuden, den langsomme vækst sparer energi, indtil forholdene ændrer til at favorisere bakterievækst1,2,3. Efter de barske forhold har bestået, bakterier spredes biofilm og genoptage en planktoniske livsstil1,2,3. Traditionelt biofilm er observeret på overflader og repræsentere en vedvarende klinisk udfordring på grund af infektion reservoirer til stede på katetre og i boligen enheder1,2,3.
Biofilmdannelse blev for nylig beskrevet for flere enterisk patogener; bakterier, der inficerer tyndtarmen eller tyktarmen4. For Shigella arter, opstår infektion i den menneskelige kolon efter transit gennem størstedelen af mave-tarmkanalen. Under passagen gennem tyndtarmen, er Shigella udsat for galde; et lipid-nedbrydende vaskemiddel udskilles i tarmen til at lette fordøjelsen af lipider mens samtidig dræber de fleste bakterier5. Enterisk patogener har en unik evne til at modstå bakteriedræbende virkningerne af galde6. Vores seneste analyse udnyttet i vivo-indkvartering kombinationer af glucose og galdesalte at demonstrere robust Biofilmdannelse i S. flexneri samt andre arter af Shigella, patogene Escherichia coliog Salmonella4. Tidligere, Salmonella enterica serovar Typhi blev vist til at danne en galde-induceret biofilm på grund af unikke kolonisering af galdeblæren under kronisk infektion7,8,9, 10. Derudover tidligere forskning med Vibrio11og Campylobacter12 demonstreret Biofilmdannelse svar på galde. Derfor analyserne udvidet galde-induceret biofilm dannelse bemærkninger til andre patogener og bidrage til at etablere demonstration af en bevaret enterisk patogen svar på galde. I modsætning til kronisk biofilm hvor bakterielt gen transskription er begrænset, og celle ældning kan forekomme1,2,3, foreslår vi, at den enteriske galde-induceret biofilm er mere forbigående karakter. Denne forbigående, virulent biofilm er stemplet af en hurtig afmontering (som ses i dispersion assay) og forøget virulence genekspression observeret i biofilm befolkning4,6.
Biofilmdannelse er en mangesidet, dynamisk proces og anvendelsen af galde salte som en igangsættende faktor er kun blevet for nylig beskrevet for mest enterisk patogener, er værktøjer og teknikker, der anvendes unikke og kreative anvendelser af traditionelle metoder. Derfor er præsenteres her tre gratis strategier til at kvantificere flere vigtige egenskaber af galde salt-induceret Biofilmdannelse, herunder bakteriel tilslutning, produktion af EPS-matrix, og spredning af levedygtige bakterier fra biofilm. Disse teknikker har været udnyttet primært for forskning med Shigella; og derfor, evaluering af andre enteriske patogener kan kræve optimering. Ikke desto mindre, positive data fra alle tre assays støtte identifikation af biofilm og fastlægge reproducerbare protokoller for galde salt-induceret Biofilmdannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse af Biofilmdannelse er udfordrende på grund af den dynamiske natur af biofilm og variabiliteten mellem stammer, materialer, laboratorier og assays. Her præsenteres flere strategier for at bestemme Biofilmdannelse i enterisk patogener efter galdesalte eksponering med eksperimentelle indsigt til fremme reproducerbarhed. Der er yderligere overvejelser at sikre reproducerbarhed. Først og fremmest anbefaler vi udfører mindst tre uafhængige forsøg hver med tekniske tre at bekræfte observationer og Statistisk sign…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Rachael B. Chanin og Alejandro Llanos-Chea for teknisk bistand. Vi takker Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski og Bobby Cherayil for de stammer, der er anvendt i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme Grant K22AI104755 (C.S.F.). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
Riferimenti
- Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
