पित्त नमक-प्रेरित-प्रवेश रोगजनकों में फिल्म गठन: पहचान और ठहराव के लिए तकनीक
Summary
इस प्रोटोकॉल को सक्षम बनाता है पाठक पित्त नमक का विश्लेषण करने के लिए एक बहुमुखी दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए जीवाणुओं की गतिशील प्रकृति पर कब्जा रोगजनकों में-प्रेरित फिल्म गठन के पालन का आकलन, extracellular बहुलक पदार्थ मैट्रिक्स गठन द्वारा बैक्टीरिया की फिल्म, और फैलाव ।
Abstract
फिल्म निर्माण एक गतिशील, multistage प्रक्रिया है कि कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियों या तनाव के समय के तहत बैक्टीरिया में होता है । के लिए प्रवेश रोगजनकों, एक महत्वपूर्ण तनाव प्रतिक्रिया जठरांत्र पारगमन के दौरान और पित्त जोखिम पर प्रेरित है, मानव पाचन का एक सामांय घटक । पित्त के जीवाणुनाशक प्रभाव को दूर करने के लिए, कई प्रवेश रोगजनकों एक फिल्म फार्म का अस्तित्व जब छोटी आंत के माध्यम से पारगमन की अनुमति के लिए परिकल्पना की । यहां हम वर्तमान के तरीके ठोस चरण पालन परख के रूप में के रूप में अच्छी तरह से extracellular बहुलक पदार्थ (EPS) मैट्रिक्स का पता लगाने और दृश्य के माध्यम से फिल्म निर्माण को परिभाषित करने के लिए । इसके अलावा, फिल्म फैलाव आकलन संक्रमण की प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया की रिहाई को ट्रिगर घटनाओं के विश्लेषण की नकल करने के लिए प्रस्तुत किया है । क्रिस्टल वायलेट धुंधला एक उच्च प्रवाह ९६-अच्छी तरह से थाली पालन परख में अनुयाई बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । eps उत्पादन मूल्यांकन दो परख, अर्थात् EPS मैट्रिक्स और अर्द्ध एक फ्लोरोसेंट-संयुग्मित polysaccharide बंधन लेक्टिन के साथ मात्रात्मक विश्लेषण के माइक्रोस्कोपी धुंधला द्वारा निर्धारित किया जाता है । अंत में, फिल्म फैलाव के माध्यम से मापा जाता है कॉलोनी गिनती और चढ़ाना । एकाधिक परख से सकारात्मक डेटा का समर्थन करता है और फिल्म के लक्षण वर्णन के लिए पित्त नमक की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है-प्रेरित अंय जीवाणु उपभेदों में फिल्म निर्माण ।
Introduction
फिल्म निर्माण एक महत्वपूर्ण जीवाणु अस्तित्व कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियों के दौरान प्रेरित रणनीति है । एंटीबायोटिक दवाओं या पोषक तत्वों या ऑक्सीजन की उपलब्धता में परिवर्तन की तरह जीवाणुनाशक यौगिकों के संपर्क बैक्टीरिया है कि जैव फिल्म गठन के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है में एक तनाव राज्य लाती है । एक फिल्म एक सतह या अंय बैक्टीरिया को बैक्टीरियल लगाव की विशेषता है और एक EPS मैट्रिक्स के स्राव के साथ मुख्य रूप से polysaccharides1,2,3से बना है । फिल्म निर्माण एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें घटनाओं का झरना एक परिपक्व अनुयाई बैक्टीरियल समुदाय1,2,3के गठन में समापन । बैक्टीरिया adhesins उत्पादन के लिए जल्दी लगाव की सुविधा जबकि adhesin जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल स्थानांतरण के लिए फिल्म परिपक्वता के दौरान लगाव को मजबूत । इसके साथ ही, EPS उत्पादन के लिए एक मैट्रिक्स में जीवाणु समुदाय के लिए प्रारंभिक तनाव से कोशिकाओं की रक्षा कोट होता है । इस फिल्म के भीतर निहित बैक्टीरिया धीमी गति से बढ़ रहे हैं; और इस तरह के रूप में, renders सबसे एंटीबायोटिक दवाओं अप्रभावी । इसके अलावा, धीमी गति से विकास ऊर्जा को संरक्षित रखता है जब तक शर्तों को बदलने के लिए बैक्टीरियल विकास1,2,3एहसान । कठोर स्थितियों के बीत जाने के बाद, जीवाणुओं को विसर्जित करना और एक planktonic जीवनशैली1,2,3को फिर से शुरू करना । परंपरागत रूप से, फिल्मों पर मनाया जाता है और एक लगातार नैदानिक चुनौती कैथेटर और में आवास उपकरणों1,2,3पर मौजूद संक्रमण जलाशयों की वजह से प्रतिनिधित्व करते हैं ।
हाल ही में कई प्रवेश रोगजनकों के लिए फिल्म निर्माण का वर्णन किया गया; बैक्टीरिया है कि छोटी आंत या4बृहदांत्र संक्रमित । शिगेला प्रजातियों के लिए, संक्रमण जठरांत्र संबंधी मार्ग के बहुमत के माध्यम से एक पारगमन के बाद मानव बृहदांत्र में होता है । छोटी आंत के माध्यम से पारित होने के दौरान, शिगेला पित्त के संपर्क में है; एक लिपिड अपमानजनक डिटर्जेंट लिपिड के पाचन को सुविधाजनक बनाने के लिए आंत में स्रावित जबकि एक साथ सबसे अधिक बैक्टीरिया की हत्या5. प्रवेश रोगजनकों पित्त की जीवाणुनाशक प्रभाव का विरोध करने के लिए एक अद्वितीय क्षमता है6. हमारे हाल ही में vivo-ग्लूकोज और पित्त लवण की तरह संयोजन में एस. flexneri के साथ ही शिगेला, रोगजनक ई कोलाईकी अंय प्रजातियों में मजबूत फिल्म गठन का प्रदर्शन विश्लेषण का उपयोग किया है, और साल्मोनेला4. इससे पहले, साल्मोनेला enterica serovar Typhi जीर्ण संक्रमण के दौरान पित्ताशय की थैली के अद्वितीय औपनिवेशीकरण के कारण एक पित्त प्रेरित सी फिल्म बनाने के लिए दिखाया गया था7,8,9, 10. इसके अतिरिक्त, Vibrio11और कैम्पिलोबैक्टर12 के साथ पूर्व अनुसंधान पित्त के जवाब में एक फिल्म के गठन का प्रदर्शन किया । इसलिए, विश्लेषण पित्त प्रेरित-फिल्म गठन की टिप्पणियों को अन्य रोगजनकों के लिए विस्तारित और पित्त के लिए एक संरक्षित रोगजनक प्रतिक्रिया के प्रदर्शन को स्थापित करने में मदद । पुरानी सी के विपरीत फिल्म है जिसमें बैक्टीरियल जीन प्रतिलेखन सीमित है और कोशिका वार्धक्य हो सकता है1,2,3, हम प्रस्ताव है कि प्रवेश पित्त प्रेरित-फिल्म प्रकृति में अधिक क्षणिक है । यह क्षणिक, विषमय फिल्म एक तेजी से विधानसभा द्वारा की पहचान की है (के रूप में फैलाव परख में देखा) और बढ़ाया डाह जीन अभिव्यक्ति में कहा गया है कि फिल्म की जनसंख्या4,6।
के रूप में फिल्म निर्माण एक बहुमुखी, गतिशील प्रक्रिया है और एक शुरुआत कारक के रूप में पित्त लवण का उपयोग केवल हाल ही में सबसे प्रवेश रोगजनकों के लिए वर्णित किया गया है, उपकरण और इस्तेमाल तकनीक पारंपरिक तरीकों के अद्वितीय और रचनात्मक अनुप्रयोगों रहे हैं । इस प्रकार, यहां प्रस्तुत तीन मानार्थ रणनीति पित्त नमक के कई महत्वपूर्ण विशेषताओं, बैक्टीरियल पालन, EPS मैट्रिक्स का उत्पादन, और इस फिल्म से व्यवहार्य जीवाणुओं के फैलाव सहित प्रेरित फिल्म गठन, कर रहे हैं । इन तकनीकों को मुख्य रूप से शिगेलाके साथ अनुसंधान के लिए उपयोग किया गया है; और इसलिए, अंय दर्जी रोगजनकों के मूल्यांकन अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । फिर भी, सभी तीन परख से सकारात्मक डेटा का समर्थन करता है और फिल्म की पहचान के लिए reproducible प्रोटोकॉल स्थापित पित्त नमक प्रेरित-फिल्म गठन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
फिल्म निर्माण के विश्लेषण के कारण और उपभेदों, सामग्री, प्रयोगशालाओं के बीच परिवर्तनशीलता, और परख के लिए गतिशील प्रकृति के लिए चुनौतीपूर्ण है । यहां, कई रणनीतियों को reproducibility को बढ़ावा देने के लिए प्रदान प?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Rachael बी Chanin और ऐलेजैंड्रो Llanos-Chea तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । हम एंथनी टी Maurelli, ब्रायन पी हर्ले, Alessio Fasano, ब्रेट ई. Swierczewski, और बॉबी Cherayil इस अध्ययन में इस्तेमाल उपभेदों के लिए धंयवाद । इस काम को राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान ग्रांट K22AI104755 (C.S.F.) ने समर्थन दिया था. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
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