Galle Salt-indusert Biofilm formasjonen i Enteric patogener: teknikker for identifikasjon og måling

Summary

Denne protokollen gjør leseren til å analysere galle salt-indusert biofilm formasjonen i enteric patogener med en mangefasettert tilnærming for å fange dynamikken i bakteriell biofilm ved å vurdere etterlevelse, ekstracellulære polymere stoff matrix formasjon, og spredning.

Abstract

Biofilm formasjon er en dynamisk, flertrinns prosess som skjer i bakterier under harde forhold eller tider med stress. For enteric patogener, er en betydelig stressrespons indusert under gastrointestinal transport og galle eksponering, en normal del av menneskelige fordøyelse. For å overvinne bakteriedrepende effekten av galle, danne mange enteric patogener en biofilm hypotesen for å tillate overlevelse når transitt gjennom tynntarmen. Her presenterer vi metoder for å definere biofilm formasjon gjennom solid-fase tilslutning analyser samt ekstracellulære polymere stoff (EPS) matrix gjenkjenning og visualisering. Videre er biofilm spredning vurdering presentert for å etterligne analyse av hendelser utløse utgivelsen av bakterier under infeksjon prosessen. Crystal violet flekker brukes til å oppdage tilhenger bakterier i en høy gjennomstrømming 96-brønns plate overholdelse av analysen. EPS produksjon vurdering bestemmes av to analyser, nemlig mikroskopi farging av EPS matrise og semi kvantitativ analyse med en fluorescently-konjugerte polysakkarid bindende Lektiner. Endelig måles biofilm spredning gjennom kolonien teller og plating. Positive data fra flere analyser støtte karakterisering av biofilm og kan brukes til å identifisere galle salt-indusert biofilm formasjon i andre bakterielle stammer.

Introduction

Biofilm dannelsen er en viktig bakteriell overlevelsesstrategi indusert under harde forhold. Eksponering for bakteriedrepende forbindelser som antibiotika eller endringer i næringsstoffer eller oksygen tilgjengelighet induserer en stresset stat i bakterier som kan lindres gjennom biofilm dannelsen. En biofilm er preget av bakteriell vedlegg til en overflate eller andre bakterier og ledsages av utskillelsen av en EPS matrise hovedsakelig består av polysakkarider^1,2,3. Biofilm formasjon er en dynamisk prosess der en kaskade av hendelser kulminerer i dannelsen av en moden tilhenger bakterielle samfunnet^1,2,3. Bakterien produserer adhesins for å lette tidlig vedlegg skifting av adhesin genet uttrykket profiler for å styrke vedlegg under biofilm modning. Samtidig, slår EPS produksjon strøk den bakterielle samfunnet i en matrise å beskytte cellene fra det første trykk. Bakterier i biofilm er langsom voksende; og som sådan, gjør de fleste antibiotika ineffektive. Videre sparer den langsomme veksten energi til forholdene endres til fordel bakterievekst^1,2,3. Etter de harde forholdene har gått, bakterier spre biofilm og gjenoppta en planktoniske livsstil^1,2,3. Tradisjonelt biofilm er observert på overflater og en vedvarende klinisk utfordring på grunn av smitte reservoarene på katetre og i-bolig enheter^1,2,3.

Biofilm formasjon ble nylig beskrevet for flere enteric patogener; bakterier som smitter tynntarmen eller kolon⁴. For Shigella arter, oppstår infeksjon i menneskelig kolon etter transitt gjennom fleste gastrointestinaltraktus. Under passasje gjennom tynntarm, er Shigella utsatt for galle; en lipid-nedverdigende vaskemiddel utskilles i tarmen til rette for fordøyelsen av lipider mens samtidig drepe de fleste bakterier⁵. Innstigning patogener har en unik evne til å motstå bakteriedrepende effekten av galle⁶. Vår siste analyse benyttet i vivo-liker kombinasjoner av glukose og galle salter å demonstrere robuste biofilm formasjon i S. flexneri og andre arter av Shigella, sykdomsfremkallende Escherichia coliog Salmonella⁴. Tidligere Salmonella enterica serovar Typhi ble vist å danne en galle-indusert biofilm på grunn av unike kolonisering av gallbladder under kronisk infeksjon^{7,8,9, 10}. i tillegg tidligere forskning med Vibrio¹¹og¹² vist biofilm formasjon svar galle. Derfor analysene utvidet galle-indusert biofilm formasjon observasjoner til andre patogener og bidra til å etablere demonstrasjon av bevarte enteric patogen svar til galle. I motsetning til kronisk biofilm som bakteriell genet transkripsjon er begrenset og celle senescence kan oppstå^1,2,3, foreslår vi at enteric galle-indusert biofilm er mer midlertidig i naturen. Denne forbigående, virulente biofilm er stemplet av en rask demontering (som sett i spredning analysen) og forbedret virulens genuttrykk observert i biofilm befolkningen^4,6. 

Biofilm formasjon er en multifaceted, dynamisk prosess og bruk av galle salter som en initiering faktor har bare vært nylig beskrevet for mest enteric patogener, er verktøy og teknikker som brukes unike og kreative programmer av tradisjonelle metoder. Dermed er presenteres her tre gratis strategier for å kvantifisere flere viktige egenskaper av galle salt-indusert biofilm formasjon, inkludert bakteriell etterlevelse, produksjon av EPS matrix og spredning av levedyktig bakterier fra biofilm. Disse teknikkene har vært benyttet for forskning med Shigella; og derfor evaluering av andre enteric patogener kan kreve optimalisering. Likevel positive data fra alle tre analyser støtter identifikasjon av biofilm og etablere reproduserbar protokoller for galle salt-indusert biofilm formasjon.

Protocol

1. forberedelse av reagenser Galle salter medium: for å forberede tryptic soya kjøttkraft (TSB) som inneholder 0,4% gallesalter (vekt/volum), resuspend 200 mg av galle salter i 50 mL autoklaveres TSB. Filteret sterilisere bruke filtere 0.22 µm. Gjør frisk medium ukentlig.Merknader: Galle salter som rutinemessig brukes er en 1:1 blanding av natrium cholate og natrium deoxycholate isolert fra ovine og storfe gallbladders. Som vist tidligere4, var tilstedeværelsen av glukose nødve…

Representative Results

I figur 1, er biofilm formasjon indusert i de fleste av seks enteric patogener testet følgende vekst i media som inneholder galle salter. En betydelig økning i tilhenger bakterier etter galle salter eksponering er observert i nesten alle stammer testet. Unntaket er enteroaggregative E. coli (EAEC); men oppmerksom indusert observasjon av Δaaf mutant4. Resultatene indikerer at ytterligere tilslutning mekani…

Discussion

Analyse av biofilm formasjon er utfordrende på grunn av dynamikken i biofilm og variasjonen mellom stammer, materialer, laboratorier og analyser. Her presenteres flere strategier for å fastslå biofilm formasjonen i enteric patogener etter galle salter eksponering med eksperimentelle innsikt forsynt for å fremme reproduserbarhet. Det er flere hensyn å sikre reproduserbarhet. Først og fremst, anbefales det at du utfører minst tre uavhengige eksperimenter med teknisk triplicates å bekrefte observasjoner og statistis…

Materials

Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
Crystal Violet	Sigma	C6158-50
Concanavalin-A FITC	Sigma	C7642-10mg
Glucose	Sigma	G7021-1KG
Bile Salts	Sigma	B8756-100G
LB Agar	Sigma	L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile	Fisher	14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635-500
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear)	TPP	92696
Flat-bottomed 96-well plates (black)	Greiner Bio-One	655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear)	TPP	92424
Glass coverslips 12mm, round	Fisher	08-774-383
96-well plate reader	Spectramax
Flourescent plate reader	Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope	Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator	Thermolyne Series 5000