En Murine pancreas Islet celle-baseret Screening for Diabetogenic miljømæssige kemikalier
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at isolere mus pancreas ø-celler for screening ROS induktion af fremmedstoffer for at identificere de potentielle diabetogenic xenobiotiske kemikalier.
Abstract
Eksponering for visse miljømæssige kemikalier i mennesker og dyr er blevet fundet for at forårsage cellulære skader i bugspytkirtlen β-celler, hvilket vil føre til udviklingen af type 2 diabetes mellitus (T2DM). Selv om mekanismerne til den kemiske-induceret β celleskader var uklare og tilbøjelige til at være kompleks, er en tilbagevendende konstatering, at disse kemikalier fremkalde oxidativt stress fører til generation af overdreven reaktive ilt arter (ROS), fremkalde skader på β-cellen. For at identificere potentielle diabetogenic miljømæssige kemikalier, isoleret vi pancreas ø-celler fra C57BL/6 mus og kulturperler islet celler i 96-brønd celle kultur plader; derefter ø-celler blev doseret med kemikalier og ROS generation blev opdaget af 2′, 7′-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescerende farvestof. Brug denne metode, vi fandt at bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyren (BaP) og polychlorerede biphenyler (PCB), kunne fremkalde høje niveauer af ROS, tyder på, at de potentielt kan fremkalde skader i ø-celler. Denne metode bør være nyttige for screening diabetogenic fremmedstoffer. Derudover kan kulturperle ø-celler også tilpasses til in vitro- analyse af kemiske-induceret toksicitet i pancreas celler.
Introduction
Stigninger i prævalensen af T2DM er blevet en global sundhedskrise i de seneste år udgør en alvorlig trussel mod folkesundheden1. Mange faktorer er blevet fundet at være kausalt forbundet med udvikling af T2DM, blandt hvilke, tilbagevendende resultaterne tyder på at et fælles konvergerende point for disse faktorer er induktion af oxidativ stress, som fører til generation af overdreven ROS2 , 3.
Et bredt spektrum af Miljøkontaminanter herunder PCB, dioxiner og BaP har vist sig for at fremkalde oxidativ stress, som kan forringe funktionen af pancreas β celler, der fører til insulinresistens og T2DM4. Selv om den fysiologiske niveau af ROS spiller en vigtig rolle i cellulære funktioner, eksponering for ROS, som overstiger kapaciteten af antioxidant system resulterer i skader på celler/væv og fører til sygdomme5. Pancreas β celler udtrykker et lavt niveau af antioxidant enzym, og således er en følsom mål for oxidative stress-medieret skader6,7. Kronisk udsættelse for høje niveauer af ROS har vist sig at forårsage stress-induceret i bugspytkirtlen celle dysfunktion5 samt insulinresistens i lever og fedtvæv8.
Det overordnede mål med dette projekt er at udvikle en celle-baseret analyse for skærmen kemikalier for deres diabetogenic potentialer baseret på deres induktion af ROS i pancreas celler. Bugspytkirtlen mangler metaboliske afgiftning og er en følsom mål for xenobiotiske-induceret skade6,7. Derfor, ved direkte måling af den ROS, der er genereret i bugspytkirtlen celler, denne analyse bør give en direkte indbyrdes tilnærmelse af den kemiske-induceret skade i bugspytkirtlen. For at udvikle denne metode, vi isoleret mus i bugspytkirtlen Holme, kulturperler den isolerede islet celle kultur betingelse med kemikalier, og udnyttet den kemiske-induceret ROS generation som udlæsningen. Denne procedure er enkel og effektiv i at identificere ROS-inducerende kemikalier i isolerede Holmen; Det kan udvikles yderligere undersøgelse af de mekanismer af toksicitet, der er specifikke for bugspytkirtlen in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akkumulere beviser tyder på, at eksponering for Miljøkontaminanter spiller en vigtig rolle i udviklingen af T2DM. Fremmedstoffer-induceret ROS er blevet anerkendt som en potentiel ætiologiske faktor, der bidrager til udviklingen af T2DM. Mennesker er udsat for en bred vifte af xenobiotiske kemikalier og der er et stort behov for nye forskningsteknikker effektivt identificere de pancreas giftstoffer og at efterforske mekanismen af toksicitet specifikke med cellerne i pancreas.
I denne unders…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et pilotprojekt tilskud fra CREH center sponsoreret af NIEHS og National Natural Science Foundation of China (nr. 31572626).
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
Riferimenti
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?. Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
