Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.
Abstract
Exposition gegenüber bestimmten Umweltchemikalien in Mensch und Tier wurde gefunden, um zelluläre Schäden der Bauchspeicheldrüse β-Zellen verursachen, die zu die Entwicklung von Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) führt. Obwohl die Mechanismen für die chemisch induzierte β Zellschädigung unklar und wahrscheinlich zu komplex waren, ist eine immer wiederkehrende Erkenntnis, dass diese Chemikalien verursachen oxidativen Stress führt zu der Generation von übermäßigen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) die Schäden zu verursachen die β-Zelle. Ermittlung potenzieller diabetogene Umweltchemikalien, isoliert wir pankreatische Inselzellen von C57BL/6 Mäusen und kultivierten Inselzellen in 96-Well Zellplatten Kultur; dann wurden die Inselzellen mit Chemikalien dosiert und die ROS-Generation wurde von 2′, 7′-dichlorofluoresceins (RLKV-DA) Fluoreszenzfarbstoff erkannt. Mit dieser Methode wir gefunden, dass Bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyren (BaP) und polychlorierten Biphenylen (PCB), können hohe Konzentrationen von ROS, was darauf hindeutet, dass sie potenziell Schaden in Inselzellen induzieren können induzieren. Diese Methode sollte für das screening von diabetogene XENOBIOTIKA nützlich sein. Darüber hinaus können die kultivierten Inselzellen auch für in-vitro- Analyse der chemisch induzierten Toxizität in Zellen der Bauchspeicheldrüse angepasst werden.
Introduction
Anstieg der Prävalenz von T2DM geworden in den letzten Jahren stellt eine ernsthafte Bedrohung für öffentliche Gesundheit1einer weltweiten Gesundheitskrise. Viele Faktoren gefunden worden zur Entwicklung des T2DM, darunter kausal verknüpft werden wiederkehrende Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine konvergente Gemeinsamkeit dieser Faktoren ist die Induktion von oxidativem Stress führt zu der Generation von übermäßigen ROS2 , 3.
Ein breites Spektrum von Umweltchemikalien wie PCB, Dioxine und BaP hat sich herausgestellt, induzieren oxidativen Stress beeinträchtigen die Funktion der Bauchspeicheldrüse β-Zellen und zu Insulin-Resistenz und T2DM4führen kann. Obwohl der physiologische Ebene von ROS in zellulären Funktionen eine wichtige Rolle spielt, ROS, die die Kapazität des antioxidativen Systems übersteigt führt zu Schäden an Zellen/Gewebe und führt zu Krankheiten5. Pankreatische β-Zellen express ein niedriges Niveau der antioxidativen Enzym, und somit ist eine sensible Zielgruppe für den oxidativen Stress-vermittelten Schäden6,7. Chronische Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von ROS wurde gezeigt, dass Stress-induzierte Pankreas Zelle Dysfunktion5 verursachen sowie Insulinresistenz in der Leber und Fettgewebe8.
Das übergeordnete Ziel dieses Projektes ist es, eine zellbasierte Assays Bildschirm Chemikalien für ihre diabetogene Potenziale basierend auf ihre Induktion von ROS in Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln. Die Bauchspeicheldrüse fehlt metabolische Entgiftung und ist ein sensibler Ziel für Fremdstoff-induzierten Schäden6,7. Daher soll dieser Assay durch direkte Messung der ROS erzeugt in den Zellen der Bauchspeicheldrüsen, eine direkte Annäherung an die chemisch induzierte Schädigung der Bauchspeicheldrüse. Um diese Methode zu entwickeln, wir Maus Pankreas Inseln isoliert, kultiviert die isolierte Insel unter Zelle Kultur Bedingung mit Chemikalien und genutzt, die chemisch induzierte ROS-Generation als das Auslesen. Dieses Verfahren ist einfach und effektiv bei der Identifizierung von ROS-induzierende Chemikalien in der isolierten Insel; Es kann für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität weiterentwickelt werden, die speziell für die Bauchspeicheldrüse in Vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammeln Beweise deutet darauf hin, dass die Exposition zu Umweltchemikalien spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des T2DM. XENOBIOTIKA-induzierte ROS wurde als ein möglicher ätiologischer Faktor zur Entwicklung des T2DM anerkannt. Menschen ein breites Spektrum von XENOBIOTIKA Chemikalien ausgesetzt sind, und es gibt ein großer Bedarf an neuartigen Forschungstechniken, effektiv die Bauchspeicheldrüse Giftstoffe zu identifizieren und zu untersuchen, den Mechanismus der Toxizität für die Zellen der Bauchspei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Pilotprojekt Stipendium CREH Zentrum gesponsert durch NIEHS und National Natural Science Foundation of China (Nr. 31572626) unterstützt.
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
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