En murin bukspottskörteln Islet Cell-baserad Screening för diabetogent miljö kemikalier
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera mus bukspottkörtelns cellöar för screening av ROS induktioner av xenobiotika för att identifiera potentiella diabetogent xenobiotiska kemikalier.
Abstract
Exponering för vissa miljömässiga kemikalier i människa och djur har visat sig orsaka cellskada i pankreas β-celler som kommer att leda till utvecklingen av typ 2-diabetes mellitus (T2DM). Även om mekanismerna för de kemisk-inducerad β cellskador var oklart och kan vara komplexa, är ett återkommande fynd att dessa kemikalier inducera oxidativ stress leder till generation av överdriven reaktiva syreradikaler (ROS) som inducerar skador till β-cellen. För att identifiera potentiella diabetogent miljö kemikalier, isolerat vi bukspottkörtelns cellöar från C57BL/6 möss och odlade cellöar i 96 brunnar cell kultur plåtar. sedan cellöar doserades med kemikalier och den ROS generationen upptäcktes av 2′, 7′-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescerande färg. Med den här metoden, Vi hittade att bisfenol A (BPA), bens [a] pyren och polyklorerade bifenyler (PCB), kunde framkalla höga nivåer av ROS, vilket tyder på att de potentiellt kan orsaka skador i cellöar. Denna metod bör vara användbar för screening diabetogent xenobiotika. Dessutom, kan de odlade cellöar också anpassas för in vitro- analys av kemisk-inducerad toxicitet i bukspottkörtelns celler.
Introduction
Ökningar i förekomsten av T2DM har blivit en global hälsa kris under de senaste åren innebär ett allvarligt hot mot folkhälsan1. Många faktorer har konstaterats vara kausalt kopplat till utvecklingen av T2DM, bland vilka återkommande fynd tyder på att en gemensam konvergerande punkt för dessa faktorer är induktion av oxidativ stress som leder till generation av överdriven ROS2 , 3.
Ett brett spektrum av miljömässiga kemikalier inklusive PCB, dioxiner och BaP har konstaterats för att inducera oxidativ stress, vilket kan försämra funktionen av pankreas β-celler och leda till insulinresistens och T2DM4. Även om den fysiologiska nivån av ROS spelar en viktig roll i cellulära funktioner, exponering för ROS som överskrider kapaciteten hos antioxidant systemet resulterar i skador på cellerna eller vävnaderna och leder till sjukdomar5. Pankreas β-celler uttrycker en låg nivå av antioxidant enzym och således är måltavla känslig för oxidativ stress-medierad skada6,7. Kronisk exponering för höga nivåer av ROS har visat sig orsaka stressinducerade bukspottskörteln cell dysfunktion5 samt insulinresistens i levern och fettväv8.
Det övergripande målet med detta projekt är att utveckla en cellbaserade test för skärmen kemikalier för deras diabetogent potential baserat på deras induktion av ROS i bukspottkörtelns celler. Bukspottkörteln saknar metabola avgiftning och är en känslig mål för xenobiotiska-inducerad skada6,7. Denna analys bör därför, genom att direkt mäta ROS genereras i bukspottkörtelns celler, innehålla en direkt uppskattning av den kemiska-inducerad skadan i bukspottkörteln. För att utveckla denna metod, vi isolerade mus Langerhanska odlade den isolerade islet cell kultur villkor med kemikalier och utnyttjade den kemisk-inducerad ROS generationen som utslaget. Proceduren är enkel och effektiv att identifiera ROS-inducerande kemikalier i isolerade Holmen; Det kan vidareutvecklas för undersökning av toxicitet mekanismer som är specifika för bukspottkörteln in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ackumulerande bevis tyder på att exponering för miljö kemikalier spelar en viktig roll i utvecklingen av T2DM. Xenobiotika-inducerad ROS har erkänts som en potentiell etiologisk faktor som bidrar till utvecklingen av T2DM. Människor utsätts för ett brett utbud av xenobiotiska kemikalier och det finns ett stort behov av ny forskningstekniker att effektivt identifiera de pankreas gifter och utreda mekanismen av toxicitet specifika för bukspottkörtelns celler.
I denna studie, utifrån pu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ett pilotprojekt bidrag från CREH center sponsras av NIEHS och National Natural Science Foundation Kina (nr. 31572626).
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
Riferimenti
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?. Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
