Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos
Summary
Aquí presentamos un protocolo para aislar células de islote pancreático de ratón para la detección de las inducciones de ROS por los xenobióticos con el fin de identificar los potenciales químicos xenobióticos diabetogenic.
Abstract
Exposición a determinadas sustancias químicas ambientales en humanos y animales se ha encontrado para causar daño celular de las células β pancreáticas que conducirá al desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Aunque los mecanismos para el daño de la célula β inducida por químicos eran probablemente sea complejo y confuso, un hallazgo recurrente es que estos productos químicos inducen estrés oxidativo que conduce a la generación de especies reactivas excesiva del oxígeno (ROS) que inducen daño a la célula β. Para identificar potenciales químicos ambientales diabetogenic, se aislaron células de los islotes pancreáticos de ratones C57BL/6 y las células del islote cultivadas en placas de cultivo celular de 96 pozos; Luego, las células del islote fueron dosificadas con productos químicos y la generación de ROS se detectó por 2′, 7′-Diclorofluoresceína (DCFH-DA) colorante fluorescente. Usando este método, encontró bisphenol A (BPA), Benzo [a] pireno (BaP) y los bifenilos policlorados (PCB), podría inducir a altos niveles de ROS, sugiriendo que potencialmente pueden inducir daño en las células del islote. Este método debe ser útil para la detección diabetogenic xenobióticos. Además, las células del islote culta también pueden ser adaptadas para el análisis en vitro de la toxicidad inducida por el producto químico en las células pancreáticas.
Introduction
Aumentos en la prevalencia de T2DM se han convertido en una crisis de salud global en los últimos años plantea una grave amenaza a la salud pública1. Se han encontrado muchos factores causal relacionada con el desarrollo de T2DM, entre los que repite resultados sugieren que un punto convergente común para estos factores es la inducción de estrés oxidativo que conduce a la generación excesiva de ROS2 , 3.
Una amplia gama de productos químicos ambientales como PCBs, dioxinas y BaP se ha encontrado para inducir el estrés oxidativo, que puede perjudicar el funcionamiento de las células β pancreáticas y llevar a resistencia a la insulina y T2DM4. Aunque a nivel fisiológico de ROS desempeña un papel importante en las funciones celulares, la exposición a ROS que excede la capacidad del sistema antioxidante provoca el daño a las células/tejidos y conduce a enfermedades5. Las células β pancreáticas expresan un bajo nivel de enzimas antioxidantes y por lo tanto están un objetivo sensible de la mediada por estrés oxidativo6,7. La exposición crónica a altos niveles de ROS se ha demostrado para causar la disfunción de células pancreáticas inducida por estrés5 así como resistencia a la insulina en el hígado y tejido adiposo8.
El objetivo general de este proyecto es desarrollar un ensayo basado en células para productos químicos de la pantalla para sus potenciales diabetogenic basados en la inducción de ROS en las células pancreáticas. El páncreas carece de desintoxicación metabólica y es un blanco sensible de daño inducido por xenobióticos6,7. Por lo tanto, midiendo directamente los ROS generados en las células pancreáticas, este análisis deben proporcionar una aproximación directa a la lesión inducida por el producto químico en el páncreas. Para desarrollar este método, aislados islotes pancreático de ratón, había cultivado el islote aislado bajo condiciones de cultivo celular con productos químicos y utiliza la generación de ROS inducida por químicos como la lectura. Este procedimiento es simple y eficaz en la identificación de productos químicos inductores de ROS en el islote aislado; pueden desarrollarse para la investigación de los mecanismos de toxicidad que son específicos para el páncreas in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La acumulación de pruebas sugiere que la exposición a químicos ambientales desempeña un papel importante en el desarrollo de T2DM. Inducida por xenobióticos ROS ha sido reconocido como un factor etiológico potencial contribuyendo al desarrollo de T2DM. Los seres humanos están expuestos a una amplia gama de productos químicos xenobióticos y hay una gran necesidad de técnicas de investigación novedosas para identificar efectivamente los toxicantes pancreáticos e investigar el mecanismo de la toxicidad específi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto piloto de centro CREH auspiciada por NIEHS y por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 31572626).
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
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