JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक से मस्तिष्क केशिकाओं का अलगाव

Published: September 12, 2018
doi:
10.3791/57346
, , , , , , , ,
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences,University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,University of Kentucky, 3Department of Neuroscience,University of Kentucky

Summary

मानव मस्तिष्क ऊतक से अलग मस्तिष्क केशिकाओं शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक नैदानिक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यहाँ, हम ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक से मस्तिष्क केशिकाओं को अलग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

शारीरिक और pathophysiological स्थितियों के तहत रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह को समझना नई चिकित्सीय रणनीतियों है कि मस्तिष्क की दवा वितरण बढ़ाने के लिए वादा पकड़ के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, मस्तिष्क संरक्षण में सुधार, और मस्तिष्क का इलाज विकारों. हालांकि, मानव रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है । इस प्रकार, वहां उपयुक्त मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है । इस संबंध में, मस्तिष्क केशिकाओं मानव मस्तिष्क ऊतक से अलग करने के लिए एक अनूठा उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के रूप में संभव के रूप में vivo स्थिति में मानव के करीब बाधा समारोह का अध्ययन । यहाँ, हम एक उच्च उपज में और लगातार गुणवत्ता और पवित्रता के साथ मानव मस्तिष्क ऊतक से केशिकाओं को अलग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । केशिकाएं यांत्रिक homogenization, घनत्व ढाल केंद्रापसारक, और निस्पंदन का उपयोग कर ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक से अलग कर रहे हैं । अलगाव के बाद, मानव मस्तिष्क केशिकाओं रिसाव परख, लाइव सेल इमेजिंग, और प्रतिरक्षा आधारित परख प्रोटीन अभिव्यक्ति और समारोह, एंजाइम गतिविधि, या intracellular संकेतन अध्ययन सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अलग मानव मस्तिष्क केशिकाओं मानव रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह के विनियमन स्पष्ट करने के लिए एक अनूठा मॉडल हैं । यह मॉडल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, जो सीएनएस विकारों के उपचार के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में मदद करेगा ।

Introduction

रक्त मस्तिष्क बाधा रक्त और मस्तिष्क के बीच एक कसकर नियंत्रित इंटरफेस है जो निर्धारित करता है कि क्या में चला जाता है और मस्तिष्क से बाहर आता है । Anatomically, endothelial कोशिकाओं रक्त मस्तिष्क बाधा रचना और एक जटिल, सतत केशिका नेटवर्क रूपों. शारीरिक रूप से, इस केशिका नेटवर्क ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के साथ मस्तिष्क की आपूर्ति करते हुए एक साथ कार्बन डाइऑक्साइड और चयापचय अपशिष्ट उत्पादों के निपटान । महत्वपूर्ण बात, सबूत का समर्थन करता है कि बाधा में परिवर्तन अल्जाइमर रोग, मिर्गी सहित कई विकृतियों के लिए योगदान, और स्ट्रोक1,2,3,4,5 , 6 , 7. मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं को भी मस्तिष्क में दवा लेने को अवरुद्ध द्वारा उपचार के लिए एक बाधा के रूप में सेवा, जैसे, ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी की कीमोथेरेपी के बाद ट्यूमर की लकीर8,9, 10. इस संबंध में, अलग मानव मस्तिष्क केशिकाओं एक अद्वितीय पूर्व vivo रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल है कि बारीकी से vivo में बाधा संपत्तियों, जो स्वास्थ्य में बाधा समारोह और रोग के अध्ययन के लिए अनुमति देता है जैसा दिखता है प्रतिनिधित्व और रोग । इस लेख में, हम एक लगातार उच्च केशिका गुणवत्ता और रक्त मस्तिष्क बाधा का अध्ययन करने के लिए उपज पर मानव मस्तिष्क से मस्तिष्क केशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

१९६९ में, Siakotos एट अल. 11 घनत्व ढाल केंद्रापसारक और कांच मनका कॉलम जुदाई का उपयोग गोजातीय और मानव मस्तिष्क ऊतक से मस्तिष्क केशिकाओं के अलगाव की रिपोर्ट करने के लिए पहले थे । बाद में Goldstein एट अल. 12 ग्लूकोज परिवहन की चयापचय गतिविधि को बनाए रखते हुए, चूहों से पृथक मस्तिष्क केशिकाओं का अध्ययन करने के लिए आवश्यक ऊतक की मात्रा में कमी करने के लिए कई निस्पंदन कदम जोड़कर इस विधि में सुधार हुआ । तब से, शोधकर्ताओं ने केशिका अलगाव प्रक्रिया कई बार अनुकूलित, प्रत्येक पुनरावृत्ति13,14,15के साथ विधि और मस्तिष्क केशिका मॉडल में सुधार । उदाहरण के लिए, Pardridge एट अल. 16 अलग गोजातीय केशिकाओं यांत्रिक homogenization के बजाय एंजाइमी पाचन का उपयोग, और फिर बाद में एक २१० µm मेष फिल्टर और एक गिलास मनका कॉलम के माध्यम से एक केशिका निलंबन पारित कर दिया । इन संशोधनों trypan नीले अपवर्जन पृथक मस्तिष्क केशिकाओं के दाग में सुधार, और इस प्रकार, endothelial कोशिका व्यवहार्यता में वृद्धि हुई । 1990 के दशक में, Dallaire एट अल। 17 अलग गोजातीय और चूहे केशिकाओं कि न्यूरॉन संदूषण और बनाए रखा चयापचय गतिविधि के स्पष्ट थे γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) और क्षारीय फॉस्फेट. २००० में, मिलर एट अल। 18, इस्तेमाल किया अलग चूहे और फोकल माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन में सुअर का मस्तिष्क केशिकाओं केशिकाओं के लुमेन में परिवहन सब्सट्रेट के संचय को दिखाने के लिए । इसके बाद, हमारी प्रयोगशाला मस्तिष्क केशिका अलगाव प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए जारी रखा है और हम पी-ग्लाइकोप्रोटीन (पी जीपी)19,20,21, स्तन कैंसर का निर्धारण करने के लिए परिवहन परख की स्थापना की है प्रतिरोध प्रोटीन (BCRP)22,23, और बहु दवा प्रतिरोध प्रोटीन 2 (Mrp2)24 परिवहन गतिविधि । २००४ में, हम हम विभिन्न सिग्नलिंग रास्ते की जांच करने के लिए अलग चूहे मस्तिष्क केशिकाओं का इस्तेमाल किया, जहां दो रिपोर्ट प्रकाशित. Hartz एट अलमें । 21, हमने पाया है कि पेप्टाइड endothelin-1 तेजी से और reversibly endothelin रिसेप्टर बी (एटबी) रिसेप्टर, नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (नग), और प्रोटीन कळेनासे सी (PKC) के माध्यम से अभिनय से मस्तिष्क केशिकाओं में पी जीपी परिवहन समारोह कम । Bauer एट अल में । 19, हम परमाणु रिसेप्टर pregnane एक्स रिसेप्टर (PXR) की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया और मस्तिष्क केशिकाओं में पी जीपी अभिव्यक्ति और परिवहन समारोह के PXR-मॉडुलन दिखाया. ट्रांसजेनिक मानव PXR चूहों के साथ प्रयोग में, हम अनुसंधान की इस लाइन का विस्तार किया और vivo hPXR सक्रियण25के माध्यम से पी-जीपी को विनियमित द्वारा बाधा के कस में दिखाया । २०१० में, Hartz एट अल. 26 इस दृष्टिकोण का उपयोग पी जीपी प्रोटीन अभिव्यक्ति और ट्रांसजेनिक मानव amyloid प्रणेता प्रोटीन (hAPP) चूहों कि hAPP व्यक्त में परिवहन गतिविधि बहाल करने के लिए । इसके अलावा, पी hAPP चूहों में जीपी बहाल काफी amyloid बीटा (Aβ)४०और Aβ४२मस्तिष्क के स्तर को कम कर दिया ।

संकेतन रास्ते का अध्ययन करने के अलावा, अलग मस्तिष्क केशिकाओं केशिका पारगम्यता जो हम केशिका रिसाव के रूप में उल्लेख में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विशेष रूप से, टेक्सास लाल रिसाव परख समय के साथ केशिका लुमेन से फ्लोरोसेंट डाई टेक्सास लाल के रिसाव का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और इन आंकड़ों तो रिसाव दरों का विश्लेषण किया जाता है । नियंत्रण केशिकाओं से उन लोगों की तुलना में वृद्धि की केशिका रिसाव दर रक्त मस्तिष्क बाधा2की शारीरिक अखंडता में परिवर्तन का संकेत मिलता है । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि वहां कई रोग बाधा व्यवधान के साथ जुड़े राज्यों, जैसे, मिर्गी, एकाधिक स्केलेरोसिस, अल्जाइमर रोग, और दर्दनाक मस्तिष्क चोट27,28,29, 30. अन्य समूहों को भी अलग केशिकाओं का उपयोग किया है संकेतन रास्ते कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति और प्रोटीन की परिवहन गतिविधि को विनियमित करने के लिए31,३२,३३,३४, ३५,३६,३७. अंत में, हम मानव मस्तिष्क केशिकाओं के अलगाव के लिए इस विधि का अनुकूलन करने के लिए जारी रखा है और, हाल ही में, हम मिर्गी के साथ रोगियों में मानव रक्त-मस्तिष्क बैरियर पर वृद्धि हुई पी जीपी अभिव्यक्ति दिखाया जब्ती-मुक्त नियंत्रण व्यक्तियों की तुलना में३८ . एक साथ लिया, इन घटनाओं का प्रदर्शन है कि अलग मस्तिष्क केशिकाओं बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

vivo में विभिंन, पूर्व vivo, और इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल में इस्तेमाल किया गया है बुनियादी अनुसंधान और औद्योगिक दवा स्क्रीनिंग, मस्तिष्क को दवा वितरण परीक्षण के लक्ष्य के साथ मुख्य रूप से३९,४०,४१ ,४२,४३,४४. अलग पूर्व vivo मस्तिष्क केशिकाओं के अलावा, वर्तमान रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल silico मॉडल में शामिल हैं, इन विट्रो कोशिका संस्कृति अलग मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं या विभिन्न से अमर सेल लाइनों के प्रजातियों में, इन विट्रो संस्कृति में मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) कि मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं में अंतर है, और एक चिप पर microfluidic मॉडल.

silico मॉडल में सबसे अधिक दवा की भविष्यवाणी की अवशोषण, वितरण, चयापचय, और उत्सर्जन (ADME) संपत्तियों के आधार पर उंमीदवारों के चयन के लिए दवा के विकास में प्रयोग किया जाता है । विधियां जैसे मात्रात्मक संरचना-संपत्ति संबंध (QSPR) मॉडल और मात्रात्मक संरचना-गतिविधि संबंध (QSAR) मॉडल लोकप्रिय तरीके पुस्तकालयों के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया दवा उम्मीदवारों के मस्तिष्क पैठ की भविष्यवाणी करने के लिए कर रहे हैं ४५ , ४६. इन मॉडलों बाधा प्रवेश संपत्तियों के लिए अणुओं स्क्रीन करने के लिए उपयोगी होते हैं ।

Betz एट अल. ४७ स्थापित monolayers के रूप में एक इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बैरियर मॉडल प्रणाली के रूप में प्रसंस्कृत मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं । इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग कर ताजा ऊतक या मानव मस्तिष्क microvessel endothelial कोशिकाओं (hCMECs) के रूप में अमर endothelial सेल लाइनों मस्तिष्क प्रवेश या यंत्रवत अध्ययन के लिए एक और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग उपकरण हो सकता है । हालांकि, मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिका संस्कृति मॉडल केशिका लुमेन के अंदर रक्त के प्रवाह के शारीरिक कतरनी तनाव की कमी, समग्र जीवविज्ञान जटिलता में सीमित हैं, और अभिव्यक्ति और महत्वपूर्ण बाधा घटकों के स्थानीयकरण में परिवर्तन से गुजरना ऐसे तंग जंक्शन प्रोटीन, सतह रिसेप्टर्स, ट्रांसपोर्टरों, एंजाइमों, और आयन चैनलों के रूप में४८,४९,५०. इसके विपरीत, endothelial monolayers hPSCs से व्युत्पंन, hCMEC/D3 संस्कृतियों की तुलना में कम सुक्रोज पारगम्यता है और कुछ रक्त मस्तिष्क बाधा ट्रांसपोर्टरों, आसंजन अणुओं, और तंग जंक्शनों५१ की ध्रुवीकरण अभिव्यक्ति होते हैं, ५२. हालांकि, इन कोशिकाओं को भी संस्कृति में गुण बदलने के अधीन हैं, और प्रणाली के अपने recapitulation के लिए मांय किया जाना चाहिए vivo बैरियर गुण५२ में ।

रक्त में नए रुझान-मस्तिष्क बाधा अनुसंधान 3 डी ऊतक संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करने के लिए कृत्रिम केशिकाओं बनाने के लिए, अंग पर चिप प्रौद्योगिकी microfluidic उपकरणों, या खोखले फाइबर प्रौद्योगिकी का उपयोग५३ उत्पंन करने के लिए, प्रयोग शामिल ५४ , ५५. कृत्रिम केशिकाओं, तथापि, मस्तिष्क केशिकाओं (3-7 µm) की तुलना में काफी बड़ा व्यास (100-200 µm) है । इसलिए, इन विट्रो में कतरनी बलों पूरी तरह से vivo स्थिति में समान नहीं है । इस में संबोधित किया है “रक्त मस्तिष्क-बैरियर पर एक चिप” microfluidic उपकरणों, जहां कृत्रिम झिल्ली फार्म “रक्त” और “मस्तिष्क” डिब्बों और तरल पदार्थ इन microfluidic कतरनी बलों पैदा उपकरणों के माध्यम से पंप कर रहे हैं । इसी प्रकार, endothelial कोशिकाओं की सह संस्कृतियों astrocytes और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के साथ विभिन्न संयोजनों में भी rheological मानकों के तहत वर्तमान बनाने के लिए खोखले फाइबर प्रौद्योगिकी के साथ प्रयोग किया गया है vivo स्थितियों५६ , ५७ , ५८. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कितनी अच्छी तरह इस मॉडल के परिवहन, चयापचय, संकेत, और दूसरों के रूप में रक्त मस्तिष्क बाधा के अंय गुणों को दर्शाता है । इन कृत्रिम केशिका और चिप मॉडल दवाओं के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन इन मॉडलों को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं को भी संस्कृति के दौरान परिवर्तन के अधीन हैं ।

जमे हुए और फिक्स्ड ब्रेन स्लाइस या प्राथमिक मस्तिष्क केशिका endothelial सेल संस्कृतियों अतिरिक्त मॉडल है किमानव microvasculature5,५९,६०,६१अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैं । उदाहरण के लिए, स्थिर मस्तिष्क ऊतक के immunohistochemistry रोगग्रस्त ऊतक की तुलना में स्वस्थ में प्रोटीन स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

ऊतक स्लाइस के अलावा और इन विट्रो मॉडल ऊपर वर्णित में, हौसले से अलग मस्तिष्क केशिकाओं रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस अलग केशिका मॉडल की सीमाएं ताजा मानव मस्तिष्क ऊतक, astrocytes और ंयूरॉंस की अनुपस्थिति, और एक अपेक्षाकृत समय लेने वाली अलगाव प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए कठिनाई शामिल हैं । अलग मस्तिष्क केशिका मॉडल का एक लाभ यह है कि इस मॉडल को बारीकी से विवो स्थिति में मिलता है और इसलिए, बाधा समारोह और शिथिलता को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात यह भी परख और आणविक तकनीक3,19,६२,६३की एक भीड़ का उपयोग कर संकेतन तंत्र विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

हमारी प्रयोगशाला सैंडर्स-एजिंग पर ब्राउन सेंटर के माध्यम से ताजा और जमे हुए मानव मस्तिष्क ऊतक दोनों के लिए उपयोग किया है (आईआरबी #B15-२६०२-M)६४। इस संदर्भ में, autopsies एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करें, दिमाग < 4 ज में प्राप्त कर रहे हैं, और सभी प्रक्रियाओं NIH के अनुरूप सबसे अच्छा अभ्यास दिशानिर्देश६५। मानव मस्तिष्क ऊतक के लिए इस अनूठी पहुँच को देखते हुए, हम स्थापित किया है और मानव मस्तिष्क ऊतक कि बरकरार, व्यवहार्य मानव मस्तिष्क केशिकाओं की एक उच्च उपज में परिणाम से मस्तिष्क केशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित । ब्याज की दो आम समापन प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि का निर्धारण कर रहे हैं । इस संबंध में, हम और दूसरों को विभिंन परख कि अलग मस्तिष्क केशिकाओं के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि के स्तर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता स्थापित किया है । इन परख पश्चिमी सोख्ता, सरल पश्चिमी परख, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर), मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR), zymography, परिवहन गतिविधि परख शामिल हैं, और केशिका रिसाव परख । इन परख मानव रोग की स्थिति में बाधा समारोह में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति, मार्ग है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि को नियंत्रित निर्धारित करते हैं, और रक्त मस्तिष्क बाधा जुड़े उपचार के लिए औषधीय लक्ष्यों की पहचान रोगों.

एक साथ लिया, हौसले से पृथक मस्तिष्क केशिकाओं रक्त मस्तिष्क बाधा के एक मजबूत और reproducible मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं । विशेष रूप से, इस मॉडल के कई विभिंन परख के साथ संयुक्त किया जा सकता है अंतिमबिंदु की एक विस्तृत सरणी के लिए बाधा समारोह का अध्ययन निर्धारित करते हैं ।

Protocol

नीचे दी गई जानकारी केंटुकी, Lexington, KY, संयुक्त राज्य अमेरिका के विश्वविद्यालय में वर्तमान सुरक्षा और विनियामक मानकों पर आधारित है । सुरक्षा एहतियात के रूप में, मानव ऊतक के साथ काम करने से पहले संस्था के जैव…

Representative Results

मानव मस्तिष्क ऊतक से अलगाव एक निलंबन मानव मस्तिष्क केशिकाओं में समृद्ध है (आंकड़ा 1b) बड़ा जहाजों की छोटी मात्रा के साथ, लाल रक्त कोशिकाओं, अन्य एकल कोशिकाओं, और कुछ सेल मलबे. कुछ क?…

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल ताजा ऊतक से बरकरार है और व्यवहार्य मानव मस्तिष्क केशिकाओं के अलगाव का वर्णन । इस खंड में, हम विस्तार से निंनलिखित पर चर्चा: 1) प्रोटोकॉल में संशोधन, 2) सामांय त्रुटियों के निवारण, 3) तकनीक…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम सभी मानव मस्तिष्क ऊतक के नमूनों (NIH अनुदान संख्या: P30 AG028383 को एजिंग पर राष्ट्रीय संस्थान से) प्रदान करने के लिए यूके-एडीसी ब्रेन टिशू बैंक में डॉ पीटर नेल्सन और सोन्या एंडरसन को धन्यवाद और स्वीकार करते हैं । हम मैट Hazzard और टॉम डोलन, सूचना प्रौद्योगिकी सेवाओं, अकादमिक प्रौद्योगिकी और संकाय सगाई, केंटुकी के चित्रमय सहायता के लिए विश्वविद्यालय धंयवाद । इस परियोजना के राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के नेशनल इंस्टीट्यूट से अनुदान संख्या 1R01NS079507 द्वारा समर्थित किया गया था (बीएसफ के लिए) और राष्ट्रीय एजिंग पर संस्थान से अनुदान संख्या 1R01AG039621 द्वारा (A.M.S.H.) । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और यह जरूरी है कि उंर बढ़ने पर मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक या राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है । लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Materials

Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4°C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50mL Falcon tubes 25/rack – 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 ml syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 ml volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 ml volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 l Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 l Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 ml) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri Dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS – part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer’s disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer’s disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer’s disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805 (2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood–brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer’s disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer’s subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709 (2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis – Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -. C., Lee, T. -. H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).

Tags

Cerebral CapillariesBlood-brain BarrierIsolationHomogenizationFicoll Density GradientFiltrationCentrifugation
check_url/it/57346?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image