घ्राण न्यूरॉन्स की Optogenetic उत्तेजना के जवाब में ट्रैकिंग Drosophila लार्वा व्यवहार
Summary
यह प्रोटोकॉल इसके घ्राण न्यूरॉन्स के एक साथ optogenetic उत्तेजना के जवाब में Drosophila लार्वा के नौवहन व्यवहार का विश्लेषण करती है । 630 एनएम तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के लिए व्यक्तिगत घ्राण न्यूरॉन्स एक लाल-स्थानांतरित चैनल rhodopsin व्यक्त सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है । लार्वा आंदोलन एक साथ, ट्रैक डिजिटल दर्ज की है, और कस्टम-लिखा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया है ।
Abstract
गंध स्रोतों की ओर नेविगेट करने के लिए कीड़ों की क्षमता उनकी पहली आदेश घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs) की गतिविधियों पर आधारित है. जबकि जानकारी का एक काफी मात्रा odorants को ORN प्रतिक्रियाओं के बारे में उत्पंन किया गया है, व्यवहार प्रतिक्रियाओं ड्राइविंग में विशिष्ट ORNs की भूमिका खराब समझ में रहता है । व्यवहार में जटिलताओं odorants के विभिन्न volatilities कि व्यक्तिगत ORNs सक्रिय करने के कारण उत्पन्न होती है, एकाधिक ORNs एकल odorants द्वारा सक्रिय है, और स्वाभाविक रूप से घ्राण उत्तेजनाओं में लौकिक रूपांतरों का उपयोग करते हुए नकल करने में कठिनाई पारंपरिक गंध-प्रयोगशाला में वितरण के तरीके । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि इसके ORNs के एक साथ optogenetic उत्तेजना के जवाब में Drosophila लार्वा व्यवहार का विश्लेषण करती है का वर्णन । optogenetic प्रौद्योगिकी यहां इस्तेमाल किया ORN सक्रियण और ORN सक्रियण के लौकिक पैटर्न के सटीक नियंत्रण की विशिष्टता के लिए अनुमति देता है । इसी लार्वा आंदोलन, ट्रैक डिजिटल दर्ज की है, और कस्टम लिखित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया है । प्रकाश उत्तेजनाओं के साथ गंध उत्तेजनाओं की जगह से, इस विधि लार्वा व्यवहार पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के क्रम में व्यक्तिगत ORN सक्रियण के एक अधिक सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है । हमारी विधि को और भी लार्वा व्यवहार पर दूसरे क्रम के प्रक्षेपण न्यूरॉन्स (पीएन) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्थानीय न्यूरॉन्स (LNs) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. इस विधि इस प्रकार घ्राण सर्किट समारोह के एक व्यापक विच्छेदन सक्षम और कैसे घ्राण ंयूरॉन गतिविधियों में अनुवाद के व्यवहार के जवाब पर अध्ययन पूरक होगा ।
Introduction
एक Drosophila लार्वा के वातावरण में घ्राण जानकारी केवल 21 कार्यात्मक विशिष्ट ORNs द्वारा महसूस किया जाता है, जो की गतिविधियों अंततः लार्वा व्यवहार1,2,3,4निर्धारित करते हैं । फिर भी, अपेक्षाकृत कम तर्क है जिसके द्वारा संवेदी जानकारी इन 21 ORNs की गतिविधियों में इनकोडिंग है के बारे में जाना जाता है । वहां इस प्रकार एक प्रयोग के लिए एक लार्वा ORN के कार्यात्मक योगदान को मापने की जरूरत है व्यवहार ।
हालांकि संवेदी प्रतिक्रिया Drosophila लार्वा ORNs के पूरे प्रदर्शनों की रूपरेखा विस्तार में अध्ययन किया गया है1,4,5, घ्राण सर्किट के लिए व्यक्तिगत ORNs के योगदान और इस तरह से करने के लिए नौवहन व्यवहार काफी हद तक अनजान रहते हैं । लार्वा व्यवहार अध्ययन में कठिनाइयों, अब तक, विशेष रूप से और अस्थाई एकल ORNs को सक्रिय करने के लिए अक्षमता के कारण पैदा होते हैं । odorants के एक पैनल कि विशेष रूप से सक्रिय 21 Drosophila लार्वा ORNs के 19 हाल ही में1वर्णित किया गया था । पैनल में प्रत्येक गंध, कम सांद्रता पर, केवल अपनी cognate ORN से एक शारीरिक प्रतिक्रिया बटोरता है । हालांकि, उच्च सांद्रता कि सामांय रूप से पारंपरिक व्यवहार परख के लिए प्रयोग किया जाता है पर, प्रत्येक गंध एकाधिक ORNs1,5,6से शारीरिक प्रतिक्रियाओं को दूर करता है । इसके अलावा, इस पैनल में odorants विभिंन volatilities कि व्यवहार अध्ययन है कि स्थिर गंध ढाल7,8के गठन पर निर्भर की व्याख्या जटिल है । अंत में, स्वाभाविक रूप से होने वाली गंध उत्तेजनाओं एक लौकिक घटक है कि प्रयोगशाला की स्थिति के तहत दोहराने के लिए मुश्किल है । यह इसलिए एक विधि है कि लार्वा व्यवहार उपाय कर सकते हैं, जबकि एक साथ एक स्थानिक और लौकिक तरीके से व्यक्तिगत ORNs को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
यहां, हम एक विधि है कि पहले से अधिक वर्णित लाभ है प्रदर्शन परख1,8लार्वा ट्रैकिंग । ट्रैकिंग Gershow एट अल में वर्णित परख । इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित वाल्व का उपयोग करता है व्यवहार arena8में गंध के एक स्थिर ढाल बनाए रखने के लिए । हालांकि, परिसर में गंध उत्तेजना सेटअप बनाने के लिए शामिल इंजीनियरिंग के स्तर के कारण, इस विधि को अंय प्रयोगशालाओं में दोहराने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, विशेष रूप से एकल ORNs सक्रिय करने के लिए odorants का उपयोग करने से संबंधित मुद्दों अनसुलझे रह । ट्रैकिंग मैथ्यू एट अल में वर्णित परख । एक सरल गंध वितरण प्रणाली का उपयोग करता है, लेकिन परिणामस्वरूप गंध ढाल परीक्षण गंध की अस्थिरता पर निर्भर है और परख1की लंबी अवधि के लिए अस्थिर है । इस प्रकार, प्रकाश उत्तेजनाओं के साथ गंध उत्तेजनाओं की जगह से, हमारे विधि ORN सक्रियण के विशिष्टता और सटीक लौकिक नियंत्रण के लाभ है और विभिंन शक्तियों की गंध ढाल के गठन पर निर्भर नहीं है ।
हमारे विधि स्थापित करने के लिए आसान है और Drosophila लार्वा नेविगेशन के पहलुओं को मापने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है । इस तकनीक को अंय मॉडल प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि शोधकर्ता अपने पसंदीदा प्रणाली के ंयूरॉन (एस) में पसंद के CsChrimson की अभिव्यक्ति ड्राइव करने में सक्षम है । CsChrimson चैनल rhodopsin का एक लाल-खिसका हुआ संस्करण है । यह तरंग दैर्ध्य है कि लार्वा phototaxis प्रणाली के लिए अदृश्य कर रहे हैं पर सक्रिय है । इसलिए हम विशिष्टता, विश्वसनीयता के साथ न्यूरॉन्स की गतिविधि में हेरफेर करने में सक्षम हैं, और reproducibility9. विषयों के आकार में परिवर्तन के लिए खाते के लिए कस्टम लिखित सॉफ्टवेयर को संशोधित करके, इस विधि आसानी से अन्य कीट प्रजातियों के लार्वा रेंगने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक विधि है कि घ्राण न्यूरॉन्स के एक साथ optogenetic सक्रियण के जवाब में Drosophila लार्वा व्यवहार की माप के लिए अनुमति देता है वर्णित है । पहले वर्णित लार्वा ट्रैकिंग विधियां1,8 ORNs को स…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्टार्टअप फंड्स ने नेवादा, रेनो यूनिवर्सिटी से और नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ के NIGMS द्वारा ग्रांट नंबर P20 GM103650 के तहत सपोर्ट किया था ।
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
Riferimenti
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