Micromanipulation av kromosomer i insekt Spermatocytes

Summary

I denne protokollen beskriver vi valg og utarbeidelse av aktuelle celler for micromanipulation og bruk av en piezoelectric micromanipulator flytte kromosomer i disse cellene.

Abstract

Micromanipulation av kromosomer har vært en viktig metode for å belyse mekanismen for kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevegelser, og har vært nøkkelen til å forstå hva styrer kromosom bevegelser under en celledeling. En dyktig biolog kan bruke en micromanipulator koble kromosomene fra spindelen, flytte kromosomer i cellen, og bruke styrker kromosomene bruker en lite glass nål med veldig fine tips. Mens forstyrrelser kan gjøres til kromosomene ved hjelp av andre metoder som optisk overtrykk og andre bruker en laser, hittil, gjør ingen andre metoden reposisjonering av cellulære komponenter på omfanget av titalls til hundrevis av mikron med liten eller ingen skade på cellen .

Valg og utarbeidelse av relevante celler for micromanipulation av kromosomer, spesielt beskriver utarbeidelse av gresshoppe og cricket spermatocyte primære kulturer for bruk i live-celle bildebehandling og micromanipulation, er beskrevet her. I tillegg viser vi byggingen av en nål brukes for å flytte kromosomer i cellen og bruk av en joystick-kontrollerte piezoelectric micromanipulator med et glass nål tilknyttet flytte kromosomer i dele celler. Et utvalg resultat viser bruk av en micromanipulator koble et kromosom fra en spindel i en primær spermatocyte og flytte det kromosomet i cellen.

Introduction

Micromanipulation har avdekket deler av mekanismen for et kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevegelser. Tidligste publikasjonen som beskriver resultatene micromanipulation eksperimenter var Robert Chambers¹. Chambers brukt en mekanisk micromanipulator med en vedlagt glass p for å undersøke cytoplasm i en rekke forskjellige celletyper. Dessverre var kontrast metoder som tillot visualisering av kromosomer, og mange andre cellulære komponenter i levende celler ikke tilgjengelig samtidig, så kamre eksperimenter ikke kan vise effekten av reposisjonering slik cellulære komponenter. Tidlig micromanipulations som endret kromosom posisjonen brukt Chambers apparatet for å feie spindel midzone i anaphase celler, viser at slike manipulasjoner kan endre plasseringen av kromosom armene i anaphase gresshoppe neuroblasts² . Nicklas og hans medarbeidere var de første til å utføre fine micromanipulations av kromosomer, strekker seg kromosomene³, koble dem fra spindelen og indusere en nyorientering^3,4, stabilisere en malorientation ved å bruke spenning til kromosomene^5,6,7, og måle kreftene som er produsert av spindler i anaphase^8,9. Annet arbeid av Nicklas lab viste at cytoplasmatiske granulater kan også være manipulert¹⁰ og at centrosomes kan flyttes av micromanipulation¹¹. Micromanipulation er ikke bare nyttig for bevegelse kromosomer, og andre cellulære komponenter. En micromanipulation nål kan ren skjære gjennom et mitotisk spindel i demembranated celler¹² eller kan brukes til å oppløse den kjernefysiske konvolutt¹³. I tillegg tilstøtende celler kan være smeltet sammen av micromanipulation^14,15.

Med slik en rekke interessante eksperimenter som kan gjøres ved hjelp av micromanipulation, er det ved første øyekast overraskende at micromanipulation eksperimenter har blitt gjort av svært få kromosom biologer. En årsak til denne mangel er at de mitotically dele kulturperler cellene som er utledet fra virveldyr vev og brukes ofte for å studere kromosom bevegelser er svært vanskelig å micromanipulate. Disse vev kultur cellene har generelt en kortikale cytoskjelett at “blir i veien” av micromanipulation p, og kromosomene enten ikke kan nås gjennom nålen eller nålen sliper gjennom cellen, fører til en celle brudd og død. Vi, og andre forskere som bruker micromanipulation, har funnet leddyr cellene skal mottakelig for micromanipulation. Leddyr spermatocytes spres enkelt under et lag av halocarbon olje og virker en mye mindre robust kortikale cytoskjelett underliggende cellemembranen under en celledeling. Dermed leddyr testiklene gir en god kilde til meiotically-dele celler (spermatocytes) og mitotically-dele celler (spermatogonia) med lett tilgjengelig kromosomene for micromanipulation. En seriell snitting av en gresshoppe spermatocyte fast under en manipulasjon avslørt at nålen aldri trenger cellemembranen; cellemembranen deformerer rundt nålen (Nicklas R.B., personlig kommunikasjon). Spermatocytes fra en rekke insekter og edderkopp taxa har vært micromanipulated vellykket, inkludert gresshopper, be mantids, frukt fluer, crane fluer, gresshopper, spittlebugs, møll, sort enke edderkopper, kjelleren edderkopper og orb-veving edderkopper ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Kultivert, mitotically-dele celler fra insekter kan være micromanipulated. For eksempel har kromosomene i gresshoppe neuroblasts i en primær kultur kromosomene som kan lett micromanipulated^2,23. Vi mistenker at de tilgjengelige kultivert linjer fra Drosophila og andre insekter blir også micromanipulatable, men vi ikke har testet teknikken med disse cellene. Vi vil vise hvordan dele celler fra gresshopper og sirisser kan tilberedes for en micromanipulation. Gresshopper er lett å få fra høyst pet butikker til enhver tid av året. Gresshopper er bare lett oppnåelig sommeren med mindre forskeren har tilgang til laboratoriet kolonien, men arten brukes (Melanoplus sanguinipes) har lett sammenslåtte celler og lange, enkle å manipulere kromosomer.

En annen grunn til hvorfor micromanipulation eksperimenter har blitt gjort av en liten håndfull biologer er at micromanipulators som flytter kromosomene godt er sjelden tilgjengelig i markedet. Vi har funnet at en joystick-kontrollerte piezoelectric micromanipulator styrer nål bevegelsen uten vibrasjoner, drift, eller lag mellom joysticken bevegelsen og nål bevegelse, men andre typer manipulators kan også lykkes presse kromosomer rundt i cellen. Micromanipulators designet av Ellis og Begg^25,26 er ideelle for micromanipulation av kromosomer, om de bruker eldre teknologi. Piezoelektriske micromanipulators er tilgjengelig og brukes ofte i elektrofysiologi; men er disse micromanipulators ikke vanligvis joysticken-kontrollert. Styrespak kontroll er nøkkelen til de jevne bevegelsene som kreves for en vellykket micromanipulation, og så en egendefinert joystick bør være konstruert å de aktuelle tilgjengelige piezoelectric micromanipulators arbeide for et kromosom micromanipulation. De joysticken-kontrollerte piezoelectric micromanipulators som fungerer best har direkte posisjon kontroll, hvor bevegelsen av joysticken oversettes direkte til en nål bevegelse.

En nydesignede piezoelectric micromanipulator kan konstrueres fra kommersielt tilgjengelig deler som kan lett erstattes og noen små 3D trykt komponenter, og det fungerer bra for kromosom micromanipulation²⁴. Micromanipulator har justerbar følsomhet, manuell grov posisjonering, og ingen vibrasjoner, drift, eller lag i p bevegelse og direkte posisjon kontroll av nålen. Forskere kan konstruere micromanipulator bruke instruksjonene tilgjengelig online²⁴. Nedenfor er metoder for å forberede en primær spermatocyte cellekultur og micromanipulating kromosomene i cellene i at kultur.

Protocol

1. utarbeidelse av primære insekt Spermatocyte cellekultur for Micromanipulation Skyv forberedelse Få et 75 x 25 mm glass lysbilde med en 20 mm diameter runde hull klippet ut i midten av lysbildet.Merk: Disse ble kuttet fra et enkelt ark vindusglass skal størrelsen på et glass lysbilde med et hull i midten. Kjøre en 25 x 25 mm #1.5 dekkglassvæske gjennom en Bunsen-brenner flamme 2 s. Bruke vakuum fett rundt kanten av hullet i av objektglass Plasser dekkglassvæ…

Representative Results

Figur 6 viser et utvalg micromanipulation av 2 tilstøtende gresshoppe primære spermatocytes i flere eksempler på mulige bruksområder for micromanipulation. Dette eksperimentet ble gjort ved hjelp av en invertert, kontrast mikroskopet. 0:00 (ganger vises er i min:s) bildet viser begge cellene før manipulering. Ett kromosom i nederste cellen vises under spenning anvendes av micromanipulation nålen (0:05, svarte pilen) og deretter helt løsrevet fra spinde…

Discussion

Med praksis kan bevegelse kromosomer i cellen bli andre natur. Nåler som er både tilstrekkelig stive og tilstrekkelig tynn-tipped er vanskelig å “få på grunn av” fabrikasjon, men dette også kommer med praksis. Pinne som er så bra at de deformere da flyttet i halocarbon olje vil ikke være nyttig for å skyve kromosomer i cellen. Pinne som er så sløv at deres tips er synlig og like stor som 1/3 av bredden på et kromosom (eller større) er svært sannsynlig å drepe cellen. Etableringen av en nål som er tilstrek…

Materials

VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25×25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order–call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300