संयोजक कोलेजन मैं सेल विस्तार और एक प्रतिक्रिया मॉडल में सेल वितरण प्रणाली के रूप में उनके संभावित उपयोग के लिए पेप्टाइड Microcarriers
Summary
हम एक macroporous microcarriers पर एक सेल विस्तार प्रोटोकॉल का प्रस्ताव है और एक छिड़काव में वितरण प्रणाली के रूप में उनके उपयोग एक सेलुलर ऊतक मैट्रिक्स बीज के लिए प्रतिक्रिया । हम भी सेल प्रसार और microcarriers पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए विभिंन तकनीकों में शामिल हैं । इसके अलावा, हम प्रतिक्रियात्मक संस्कृतियों के बाद कोशिकाओं की कार्यक्षमता का प्रदर्शन ।
Abstract
ऊतक इंजीनियरिंग एक होनहार क्षेत्र, ऊतकों और प्रत्यारोपण प्रयोजनों के बारे में अंगों पर बढ़ती मांग के लिए समाधान विकसित करने पर ध्यान केंद्रित है । इस प्रक्रिया के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए जटिल है, और सेल के विकास और भेदभाव का मार्गदर्शन करने के लिए विशिष्ट कोशिका प्रकार, पाड़, और शारीरिक या जैव रासायनिक उत्तेजनाओं का एक उपयुक्त संयोजन भी शामिल है । Microcarriers एक अपील उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक तीन आयामी (3 डी) microenvironment में कोशिकाओं का विस्तार, क्योंकि वे उच्च सतह प्रदान करने के लिए मात्रा अनुपात और अधिक निकटता की नकल vivo स्थिति में पारंपरिक दो आयामी तरीकों की तुलना में । संवहनी प्रणाली, कोशिकाओं के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति और अपशिष्ट हटाने सुनिश्चित करने, इंजीनियर ऊतकों पैदा जब एक महत्वपूर्ण इमारत ब्लॉक का गठन किया । वास्तव में, सबसे निर्माण के बाद विफल संवहनी समर्थन की कमी के कारण प्रत्यारोपित किया जा रहा है । इस अध्ययन में, हम संयोजक कोलेजन पर endothelial सेल विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान स्पिनर कुप्पी और उपप्रतिक्रियाओं में गतिशील शर्तों के तहत microcarriers आधारित है, और हम इस सेटिंग सेल व्यवहार्यता और कार्यशीलता में निर्धारित करने के लिए कैसे समझा । इसके अलावा, हम अतिरिक्त टुकड़ी आवश्यक कदम के बिना vascularization प्रयोजनों के लिए सेल डिलीवरी के लिए एक विधि का प्रस्ताव । इसके अलावा, हम एक सेलुलर जैविक मैट्रिक्स पर एक छिड़काव प्रतिक्रियाकर्ता में सेल vascularization क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं । हम मानते है कि प्रस्तुत विधियों का उपयोग नैदानिक अभ्यास में ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक बड़ी रेंज के लिए नए सेल आधारित उपचारों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकता है ।
Introduction
ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में एक सामांय समस्या की जरूरत के स्थान पर सही भेदभाव phenotype के साथ एक उच्च कोशिका द्रव्यमान उपज है । microcarriers के इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए आवेदन १९६७ में इस तरह की त्वचा, हड्डी, उपास्थि, और tendons1के बड़े पैमाने पर पीढ़ी के लिए आर्थोपेडिक ऊतक इंजीनियरिंग के रूप में क्षेत्रों में तारीख को बढ़ाने के महत्व के साथ शुरू कर दिया । वे अतिसूक्ष्म तीन आयामी (3 डी) सब्सट्रेट पर कोशिकाओं का विस्तार करके निलंबन संस्कृतियों के2 के समान तरीके में अनुयाई संस्कृतियों की हैंडलिंग की अनुमति देते हैं । जिससे कोशिकाओं को एक सजातीय पोषक तत्व की आपूर्ति और सेल मैट्रिक्स बातचीत का अनुभव है कि vivo3,4 भेदभाव जो अक्सर 2d दृष्टिकोण5में समय पर खो दिया है के बेहतर रखरखाव के लिए सीसा । एक उच्च सतह से मात्रा अनुपात-अंततः उच्च कोशिका पैदावार के लिए अग्रणी6,7, उच्च गैस और पोषक तत्वों विनिमय स्थैतिक प्रणालियों के लिए8की तुलना दरों, संभावना को विनियमित करने के लिए और संस्कृति के अधीन करने के लिए शारीरिक 9उत्तेजनाओं, और विस्तार की प्रक्रिया7 के ऊपर स्केलिंग के लिए संभावित आगे लाभ कर रहे हैं । कई सुविधाओं जैसे व्यास, घनत्व, porosity, भूतल प्रभारी, और आसंजन गुण10,11 अलग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्म और स्थूल-वाहक भेद । हालांकि, मुख्य लाभ में से एक साइट दोष या मांग करने के लिए microtissues के रूप में उनके प्रसव की क्षमता है ।
अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग में microcarrier प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों के लिए, हम एक पिछले रिपोर्ट में सचित्र12 एक नया microcarrier प्रकार का उत्पादन एक संयोजक कोलेजन का गठन मैं पेप्टाइड (आरसीपी, Cellnest के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध). यह नया microcarrier एक नैदानिक परिदृश्य में सेल डिलीवरी के लिए जरूरत के रूप में पाड़ और कोशिका उत्पादन के लिए जीएमपी-अनुरूपित अप स्केलिंग की अनुमति देता है । इस संदर्भ में, पाड़ स्थिरता, गिरावट की दर की ट्यूनिंग, और एक अनुकूल crosslinking रणनीति के उचित विकल्प के माध्यम से सतह संपत्तियों के लिए चयनित आवेदन, ब्याज या लक्ष्य ऊतक के सेल प्रकार13के लिए तकनीक अनुकूलन की अनुमति देता है । विशेष रूप से, चिकित्सीय आवेदन14 के लिए एक इंजेक्शन कोशिका वितरण प्रणाली के रूप में इस microcarrier के संभावित रोजगार एक नैदानिक सेटिंग में उन्हें विशेष रूप से दिलचस्प बनाता है.
इस पत्र में, हम इसलिए अलगाव और मानव अस्थि मज्जा के विस्तार के लिए संवर्धन प्रक्रिया वर्णन-व्युत्पंन mesenchymal stromal कोशिकाओं (hBMSCs) और मानव चमड़े का microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMECs) पर कोलेजन-I-आधारित संयोजक पेप्टाइड-आधारित microcarriers, और एक नैदानिक सेटिंग में वितरण के लिए उनकी तैयारी. इसके अलावा, हम अतिरिक्त प्रोटोकॉल आरोपण पर सेल व्यवहार्यता के रखरखाव के लिए उपयोगी का वर्णन ।
कोशिका व्यवहार्यता के बाद आरोपण वास्तव में दृढ़ता से vascularization पर निर्भर है15,16,17, जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का आदान प्रदान सुनिश्चित करता है और अपशिष्ट हटाने की सुविधा. एक दृष्टिकोण का गठन करने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग में vascularization चुनौतियों को दूर करने और बनाए रखने के सेल व्यवहार्यता, संस्कृति माध्यम के छिड़काव जिससे ऑक्सीजन और पोषक तत्वों18प्रदान करने के माध्यम से । यहां, हम एक में इन विट्रो विधि का वर्णन करने के लिए आरसीपी microcarriers से एक microvascular endothelial कोशिकाओं के प्रवास की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक और उनके लिए डी नोवो vascularization और angiogenesis में योगदान करने की क्षमता । इस जैव मैट्रिक्स सुअर jejunum BioVaSc (जैविक संवहनी पाड़), कोलेजन और elastin में अमीर और संरक्षित संवहनी संरचनाओं, जो एक खिला धमनी और एक draining नस19 है कि किया गया है शामिल है के साथ संपंन खंड है 20आरोपण मुद्दों के लिए आवेदन किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
microcarrier का एक मुख्य लक्ष्य कोशिकाओं के विस्तार है, जबकि अपने विभेद को बनाए रखने के क्रम में जरूरत के स्थान पर कोशिकाओं को वितरित करने के लिए । प्रतिनिधित्व विधि आरसीपी microcarriers जहां कोशिकाओं को संलग्न कर रहे ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान अनुदान समझौते n ° ६०७०५१ (जैव प्रेरणा) के तहत यूरोपीय संघ के सातवें ढांचे के कार्यक्रम FP7/2007-2013 से धन प्राप्त हुआ है । हम धंयवाद Carolien वान Spreuwel-Goossens Fujifilm विनिर्माण यूरोप B.V. से, आरसीपी विनिर्माण के दौरान तकनीकी सहायता के लिए, और वर्नर Stracke Fraunhofer अनुसंधान सिलिकेट के लिए आईएससी संस्थान से, SEM विश्लेषण के साथ सहायता के लिए ।
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
Riferimenti
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O’Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O’Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
