Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie
Summary
Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.
Abstract
Kulturen der Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen (MoDC) generiert aus Maus Knochenmark mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) haben vor kurzem erkannt worden, heterogener als zuvor geschätzt werden. Diese Kulturen enthalten routinemäßig MoDC sowie Monocyte-abgeleiteten Makrophagen (MoMac) und sogar einige weniger entwickelten Zellen wie Monozyten. Das Ziel dieses Protokolls ist es, bieten eine einheitliche Methode zur Identifizierung und Trennung von den vielen Zelltypen in diesen Kulturen, wie sie sich entwickeln, so dass ihre spezifischen Funktionen weiter untersucht werden können. Die hier vorgestellten sortierungsstrategie trennt Zellen zuerst in vier Populationen basierend auf Ausdruck der Ly6C und CD115, die vorübergehend von Zellen exprimiert werden, wie sie in der GM-CSF-orientierte Kultur zu entwickeln. Diese vier Populationen gehören gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen CMP (Ly6C, CD115), Granulozyten/Makrophagen Stammväter oder GMP (Ly6C +, CD115), Monozyten (Ly6C +, CD115 +), und Monocyte-abgeleiteten Makrophagen oder MoMac (Ly6C, CD115 +). CD11c ist auch hinzugefügt, um die Sortierung Strategie, zwei Populationen innerhalb der Ly6C-CD115-Bevölkerung zu unterscheiden: CMP (CD11c-) und MoDC (CD11c +). Zu guter Letzt können zwei Populationen innerhalb der Ly6C-CD115 + Bevölkerung basierend auf der Ebene der MHC-Klasse II Ausdruck weiter unterschieden werden. MoMacs express untere Ebenen der MHC-Klasse II, während ein Monocyte abgeleitet-DC-Vorläufer (MoDP) höheren MHC Klasse II drückt. Diese Methode ermöglicht die sichere Trennung von mehreren Entwicklungsgeschichtlich verschiedene Populationen in Zahlen für eine Vielzahl von Funktions- und Entwicklungsstörungen Analysen ausreichend. Wir zeigen eine solche funktionelle auslesen, die differenzierten Antworten dieser Zelltypen auf Stimulation mit Pathogen-Associated molekulare Muster (PAMPs).
Introduction
Kultivierung der murinen Knochenmarkzellen mit dem Zytokin ist Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) als eine Methode verbreitet Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen (MoDC; auch bekannt als entzündliche DC) in großer Zahl 1zu generieren, 2,3,4,5. Diese Zellen sind sehr nützlich in einer Vielzahl von Studien von dendritischen Zellen (DC) Funktion 6,7,8gewesen. In der Regel diese murinen Knochenmarkzellen für 6-8 Tage kultiviert werden und dienen dann zur Studie von dendritischen Zellen Funktion 5. Diese Kulturen war lange vor allem homogen, bestehend aus einer Mehrheit von differenzierten MoDC betrachtet worden. Vor kurzem, ist deutlich geworden, dass am Ende dieser 6 – 8 Tage Kultur gibt es in der Tat viele MoDC, sowie einen großen Teil der differenzierten Monocyte abgeleiteten Makrophagen (MoMacs) 9,10,11. Unsere eigenen Studien haben diese Ergebnisse zeigen, dass andere Teilmengen von weniger entwickelten Zellen, wie MoDC Vorstufen (MoDP) und Monozyten, in den Kulturen bei niedriger Frequenz auch nach 7 Tagen 10 bleibenweiter ausgebaut. Somit konnten Studien von dendritischen Zellen (DC)-Funktion, die mit Zellen, die durch dieses System erzeugt die Antworten einer größeren Kohorte von Zelltypen reflektieren, als bisher angenommen.
Wir haben sehr viel gelernt aus der Studie von GM-CSF-generierte MoDC in Bezug auf die Funktion dieser Zellen in der Endphase der Differenzierung 12,13,14. Wir verstehen jedoch deutlich weniger über der Entwicklung weg von diesen Zellen 2,15,16 und des wie und wann sie spezifische weisen Funktionen wie: Reaktionsfähigkeit auf Pathogen Associated Molecular Muster (PAMPs), Phagozytose, Antigen Verarbeitung und Präsentation 13und antibakterielle Aktivität. Ein Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von konventionellen Flt3L angetrieben DC Stammväter und Vorläufer wurde gemeldeten 17. Isolierung von diesen unterschiedlichen Populationen wurde erreicht mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-)-gebeizt Knochenmarkzellen (um teilenden Zellen zu verfolgen) und Kultur in Flt3L für 3 Tage. Zellen wurden aus positiven Zellen erschöpft und in Vorläufer und Wegbereiter Populationen basierend auf CD11c Ausdruck 17sortiert. Ein anderer Ansatz von Leenen Gruppe, frühen Vorfahren der DC in der GM-CSF-orientierte Kultur zu identifizieren war, basierte auf CD31 und Ly6C 18Zellen Sortieren. Das ursprüngliche Ziel war die Schaffung eine ähnliche Methode für den Erhalt der Stammväter und Vorstufen von GM-CSF-orientierte MoDC. Aufgrund der spezifischen Zelltypen von GM-CSF generiert passten wir das Konzept und Sortierung Strategie basierend auf Ausdruck der Moleküle, die in frühen und späteren Phasen der Entwicklung zum Ausdruck gebracht wurden. Wir bestimmt letztlich, Ly6C, CD115 (CSF-1-Rezeptor), und CD11c wurden die besten Marker für diese Zelle Unterscheidung 10Typen.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von Zellen auf mehrere Phasen der Entwicklung den Weg der Differenzierung, angetrieben von GM-CSF: gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMP), Granulozyten-Makrophagen Vorläuferzellen (GMP), Monocyte, Monocyte-abgeleiteten Makrophagen (MoMac) und DC (MoDC) Monocyte-abgeleitet. Die MoMac Bevölkerung kann weitere basierend auf Ebene der MHC-Klasse II Ausdruck getrennt werden enthüllt eine MoDC Vorläufer Bevölkerung (MoDP) 10. Wir nutzen eine High-Speed-Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Strategie um diese 5 Populationen anhand der Ausdruck Ly6C, CD115 und CD11c zu isolieren. Wir zeigen dann die Prüfung dieser Zellen im funktionellen Assays enthüllt ihre Reaktionen auf PAMP Stimulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht Isolation der GM-CSF-orientierte Vorläufer und Wegbereiter Zelltypen in Zahlen für verschiedene Arten von Analysen einschließlich der biochemischen Tests, Tests der Zellfunktion in Vitrooder Instillation in Vivoausreichend. Diese Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Monocyte-abgeleitete Dendritische Zelle Entwicklung, ermöglichen die zuverlässige Isolierung und Identifizierung von Zellen in dieser Weg der Entwicklung als auch die differenziert…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von Alison Kirche Vogel an Auburn Universität Schule von Veterinärmedizin Flow Cytometry Einrichtung, für Mittel aus der NIH EHS R15 R15 AI107773 und für die Zell- und Molekularbiologie-Programm an der Auburn University für Sommer Forschungsförderung, PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
Riferimenti
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