एक उपंयास सेल छँटाई रणनीति का उपयोग कर Murine अस्थि मज्जा से माइलॉयड Progenitors और वृक्ष सेल पुरोगामी की बड़ी संख्या की पीढ़ी
Summary
यहां हम की पहचान करने और जीएम की बड़ी संख्या अलग-सीएसएफ प्रेरित माइलॉयड उच्च गति सेल छंटाई का उपयोग कर कोशिकाओं के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । पांच अलग आबादी (आम माइलॉयड progenitors, granulocyte/मैक्रोफेज progenitors, monocytes, monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज, और monocyte-व्युत्पंन dc) Ly6C और CD115 अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाना जा सकता है ।
Abstract
monocyte की संस्कृतियों-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं (moDC) माउस अस्थि मज्जा से उत्पंन Granulocyte का उपयोग-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ) हाल ही में पहले की सराहना की तुलना में अधिक विषम होने के लिए मांयता प्राप्त किया गया है । इन संस्कृतियों नियमित रूप से moDC के रूप में अच्छी तरह से monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज (moMac), और यहां तक कि कुछ कम विकसित कोशिकाओं monocytes के रूप में होते हैं । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए पहचान और इन संस्कृतियों में मौजूद कई कोशिका प्रकार की जुदाई के रूप में वे विकसित करने के लिए एक सुसंगत विधि प्रदान करना है, ताकि उनके विशिष्ट कार्य आगे की जांच की जा सकती है । छंटाई रणनीति यहां प्रस्तुत की चार Ly6C और CD115 की अभिव्यक्ति के आधार पर आबादी में पहले कोशिकाओं अलग, दोनों जिनमें से क्षणिक कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे है के रूप में वे जीएम-सीएसएफ-संस्कृति संचालित में विकसित । इन चार आबादियों में आम माइलॉयड progenitors या सीएमपी (Ly6C-, CD115-), granulocyte/मैक्रोफेज progenitors या जीएमपी (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +), और monocyte-व्युत्पन्न मैक्रोफेज या moMac (Ly6C-, CD115 +) शामिल हैं । CD11c भी छँटाई रणनीति में जोड़ा जाता है Ly6C के भीतर दो आबादी भेद-, CD115-जनसंख्या: सीएमपी (CD11c-) और moDC (CD11c +). अंत में, दो आबादी आगे Ly6C-, CD115 + MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर जनसंख्या के भीतर प्रतिष्ठित हो सकता है । MoMacs एक्सप्रेस MHC द्वितीय श्रेणी के निचले स्तर, जबकि एक monocyte डीसी प्रणेता (moDP) उच्च MHC वर्ग द्वितीय व्यक्त करता है । इस विधि कार्यात्मक और विकासात्मक विश्लेषण की एक किस्म के लिए पर्याप्त संख्या में कई विकास विशिष्ट आबादी के विश्वसनीय अलगाव के लिए अनुमति देता है । हम एक ऐसी कार्यात्मक readout पर प्रकाश डाला, रोगज़नक़ के साथ उत्तेजना के लिए इन सेल प्रकार के अंतर प्रतिक्रियाओं-आणविक पैटर्न (PAMPs) जुड़े ।
Introduction
cytokine Granulocyte-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के साथ murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं के संवर्धन व्यापक रूप से बड़ी संख्या 1में monocyte-व्युत्पन्न वृक्ष कोशिकाओं (moDC; भी भड़काऊ डीसी के रूप में जाना जाता है) उत्पन्न करने के लिए एक विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है, 2,3,4,5. ये कोशिकाएं वृक्ष सेल (DC) फंक्शन 6,7,8के अध्ययन की एक किस्म में बेहद उपयोगी रही हैं । आमतौर पर, इन murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं 6-8 दिनों के लिए संस्कृति और फिर वृक्ष सेल समारोह 5के अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इन संस्कृतियों लंबे समय ज्यादातर समरूप माना गया था, विभेदित moDC के बहुमत से मिलकर । हाल ही में, यह है कि यह 6 के अंत में स्पष्ट हो गया है-8 दिन संस्कृति अवधि, वहां वास्तव में कई moDC हैं, साथ ही साथ विभेदित monocyte का एक बड़ा सबसेट-मैक्रोफेज (moMacs) 9,10,11व्युत्पंन । हमारे अपने अध्ययन आगे इन moDC पुरोगामी (moDP) और monocytes के रूप में कम विकसित कोशिकाओं के अन्य सबसेट का प्रदर्शन है कि इन निष्कर्षों को बढ़ाया है, कम आवृत्ति पर भी 7 दिन 10के बाद संस्कृतियों में रहते हैं. इस प्रकार, वृक्ष कोशिकाओं के अध्ययन (डीसी) समारोह इस प्रणाली द्वारा उत्पंन कोशिकाओं का उपयोग कर सेल प्रकार के एक व्यापक पलटन की प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित से पहले की सराहना की ।
हम अंतर 12,13,14के अंतिम चरणों में इन कोशिकाओं के समारोह से संबंधित जीएम-सीएसएफ-जनित moDC के अध्ययन से एक महान सौदा सीखा है । हालांकि, हम इन कोशिकाओं के विकास मार्ग के बारे में काफी कम समझते हैं 2,15,16 और कैसे और जब वे इस तरह के रूप में विशिष्ट कार्यों का प्रदर्शन: रोगज़नक़ के लिए जवाबदेही आणविक जुड़े पैटर्न (PAMPs), phagocytosis, प्रतिजन प्रसंस्करण और प्रस्तुति 13, और विरोधी बैक्टीरियल गतिविधि । पारंपरिक Flt3L संचालित डीसी progenitors और पुरोगामी की बड़ी संख्या के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल 17बताया गया है । इन अलग आबादी का अलगाव carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) का उपयोग कर हासिल किया गया था-अस्थि मज्जा कोशिकाओं दाग (कोशिकाओं को विभाजित ट्रैक करने के लिए) और Flt3L में संस्कृति 3 दिनों के लिए । कोशिकाओं तो linage सकारात्मक कोशिकाओं के समाप्त हो गए थे और जनक और अग्रदूत CD11c अभिव्यक्ति 17के आधार पर आबादी में हल । Leenen समूह द्वारा एक और दृष्टिकोण जीएम-सीएसएफ-संचालित संस्कृति में डीसी के जल्दी progenitors की पहचान करने के लिए CD31 और Ly6C 18के आधार पर कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए किया गया था । प्रारंभिक लक्ष्य progenitors और जीएम-सीएसएफ चालित moDC के अग्रदूतों को प्राप्त करने के लिए एक समान विधि बनाने के लिए किया गया था । विशिष्ट कोशिका जीएम द्वारा उत्पंन प्रकार-सीएसएफ के कारण, हम दृष्टिकोण और छंटाई अणुओं है कि विकास के प्रारंभिक और बाद के चरणों में व्यक्त किए गए की अभिव्यक्ति के आधार पर रणनीति अनुकूलित । हम अंततः निर्धारित किया है कि Ly6C, CD115 (सीएसएफ-1 रिसेप्टर), और CD11c इन सेल प्रकार 10भेद के लिए सबसे अच्छा मार्करों थे ।
यहां, हम जीएम द्वारा संचालित भेदभाव के मार्ग के साथ विकास के कई विशिष्ट चरणों में कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि वर्तमान-सीएसएफ: आम माइलॉयड जनक (सीएमपी), Granulocyte-मैक्रोफेज जनक (जीएमपी), monocyte, monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज (MoMac) और monocyte-व्युत्पन्न डीसी (MoDC). moMac जनसंख्या और MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर अलग किया जा सकता है, एक moDC प्रणेता जनसंख्या (moDP) 10खुलासा । हम Ly6C, CD115, और CD11c की अभिव्यक्ति के आधार पर इन 5 आबादी को अलग करने के लिए एक उच्च गति प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) रणनीति का उपयोग. हम तो कार्यात्मक परख PAMP उत्तेजना को अपनी प्रतिक्रियाओं खुलासा में इन कोशिकाओं की परीक्षा का प्रदर्शन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल जीएम-सीएसएफ के अलगाव की सुविधा जनक और अग्रदूतों की संख्या में संकेतक सेल प्रकार जैव रासायनिक परख सहित विश्लेषण के कई प्रकार के लिए पर्याप्त, इन विट्रो मेंसेलुलर समारोह की परख, या vivo मे…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एलिसन चर्च बर्ड से तकनीकी सहायता के लिए Auburn विश्वविद्यालय के स्कूल में पशु चिकित्सा प्रवाह Cytometry सुविधा के लिए, NIH से धन के लिए ईएचएस R15 R15 AI107773 और Auburn विश्वविद्यालय में सेलुलर और आणविक जीवविज्ञान कार्यक्रम के लिए आभारी है PBR के लिए ग्रीष्मकालीन अनुसंधान के लिए धन ।
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
Riferimenti
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
