Summary

Поколение большого числа миелоидного прародителями и дендритных клеток прекурсоров из мышиных костного мозга с помощью Роман ячейку Сортировка стратегия

Published: August 10, 2018
doi:

Summary

Здесь мы предоставляем метод для выявления и изоляции большого числа ГМ-КСФ инициативе миелоидных клеток, используя высокую скорость сортировки клеток. Пять различных популяций (общие миелоидного прародителями, предшественники гранулоцитов/макрофагов, моноциты, моноцитарных макрофагов и моноцитарных DCs) могут быть определены на основе Ly6C и CD115 выражения.

Abstract

Культур моноцитарных дендритных клеток (moDC) из костного мозга мыши с помощью гранулоцитарно-макрофагальный колонии стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) недавно были признаны быть более неоднородными, чем ранее высоко. Эти культуры обычно содержат также моноцитарных moDC макрофагов (moMac) и даже некоторые менее развитые клетки, такие как моноцитов. Цель настоящего Протокола заключается в том, предоставить согласованный метод для выявления и отделения многих типов клеток, присутствующие в этих культурах, как они развиваются, так, что их конкретные функции может быть дальнейшее расследование. Стратегию сортировки, представленные здесь разделяет клетки сначала на четыре населения на основе выражения Ly6C и CD115, оба из которых выражаются временно клетками, как они развиваются в ГМ-КСФ driven культуры. Эти четыре группы населения включают общие миелоидного прародителями или CMP (Ly6C-, CD115-), предшественники гранулоцитов/макрофагов или GMP (“Ly6C +”, “CD115-“), моноцитов (Ly6C +, CD115 +) и моноцитарных макрофаги или moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c также добавляется в стратегию сортировки различать две популяции в пределах Ly6C-, CD115-население: CMP (CD11c-) и moDC (CD11c +). Наконец две популяции могут различаться далее в пределах Ly6C-, CD115 + населения, основанные на уровень MHC класса II выражение. MoMacs Экспресс более низкий уровень MHC класса II, в то время как прекурсор моноцитарных DC (moDP) выражает выше MHC класса II. Этот метод позволяет для надежной изоляции несколько развивающих собственный населения в цифрах достаточно для различных анализов, функциональной и развития. Мы выделяем один из таких функциональных индикация, дифференциальной ответы этих типов клеток для стимуляции с Pathogen-Associated молекулярных структур (PAMPs).

Introduction

Культивирование клеток костного мозга мышиных с цитокина гранулоцитарно-макрофагальный колонии стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) широко используется как метод для создания моноцитарных дендритных клеток (moDC; также известен как воспалительные DC) в больших количествах 1, 2,3,4,5. Эти клетки были чрезвычайно полезными в различных исследований дендритных клеток (DC) функция 6,,78. Как правило эти клетки костного мозга мышиных культивировали для 6-8 дней и затем используются для изучения дендритные клетки функции 5. Эти культуры давно считается основном однородной, состоящий из большинства дифференцированных moDC. Совсем недавно стало ясно, что в конце этого периода 6-8 день культуры, есть действительно много moDC, а также большое подмножество дифференцированной моноцитарных макрофагов (moMacs) 9,10,11. Далее наши собственные исследования расширили эти результаты демонстрируют, что другие подмножеств менее развитых клеток, таких как moDC прекурсоров (moDP) и моноцитов, остаются в культурах низкой частотой даже после 7 дней 10. Таким образом исследования дендритных клеток (DC) функции с использованием клеток, порожденных этой системы может отражать ответы широкой когорты типов клеток, чем ранее высоко.

Мы узнали многое из сферы исследования ГМ-КСФ генерируется moDC, касающиеся функции этих клеток в заключительной стадии дифференцировки 12,,1314. Однако, мы понимаем значительно меньше о пути развития этих клеток 2,,1516 и как и когда они выставки конкретные функции, такие как: реагировать возбудителя связанные молекулярные Шаблоны (PAMPs), фагоцитоз, обработки и презентации антигена 13и антибактериальная активность. Протокол для изоляции большого числа обычных Flt3L-driven DC прародителями и прекурсоров был сообщил 17. Изоляция этих различных групп населения была достигнута с помощью Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE)-окрашенных клеток костного мозга (для отслеживания деления клеток) и культуры в Flt3L на 3 дня. Клетки затем были истощены построчная оплата позитивных клеток и рассортированы прародителем и прекурсоров населения, основанные на CD11c выражение 17. Другой подход Leenen в группы для выявления ранних прародителями DC в ГМ-КСФ driven культуры был для сортировки клеток, основанные на CD31 и Ly6C 18. Первоначальной целью было создать аналогичный метод для получения прародителями и прекурсоров ГМ-КСФ driven moDC. Из-за определенных ячеек типы, созданные с помощью GM-CSF мы адаптировали подход и сортировка стратегию, основанную на экспрессию молекул, которые были высказаны на ранних и более поздних стадиях развития. Мы в конечном счете определил, что Ly6C, CD115 (РСУ-1 рецепторов), и CD11c были лучшие маркеры для разграничения этих клеток типов 10.

Здесь мы представляем метод для изоляции клеток в несколько различных этапов развития по пути дифференциации, движимый ГМ-КСФ: общие миелоидного Progenitor (CMP), гранулоцитарно-макрофагального Progenitor (GMP), моноцитов, макрофагов, моноцитарных (MoMac) и моноцитарных DC (MoDC). MoMac населения можно далее подразделить на основе на уровень MHC класса II выражение, выявление прекурсоров moDC населения (moDP) 10. Мы используем высокоскоростной флуоресценции активированный ячейку Сортировка (FACS) стратегия изолировать эти 5 населения на основе выражения, Ly6C, CD115 и CD11c. Затем мы показываем изучение этих клеток в функциональных анализов, раскрывая свои ответы PAMP стимуляции.

Protocol

Все животные работы был одобрен Auburn университета институциональных животное уход и использование Комитетом согласно рекомендациям, изложенным в руководстве для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здоровья. 1. Подготовка к коллекции кос?…

Representative Results

В попытке сохранить как много каналов, доступных для анализа как можно, жизнеспособные клетки регулярно отбирались на основе прямых и сбоку разброс, за исключением очень маленьким и очень гранулированных событий (типичная ворота применяется ко всем, что точка участко…

Discussion

Этот протокол способствует изоляции ГМ-КСФ driven прародителем и прекурсоров типов клеток в количествах, достаточных для нескольких видов анализов, включая биохимические анализы, анализов клеточную функцию в пробирке, или инстилляции в естественных условиях. Этот метод предст?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны за технической помощи от Элисон церковь птица в Auburn университета Школа по ветеринарной медицины потока цитометрии объект, для финансирования из низ EHS R15 R15 AI107773 и клеточной и молекулярной биологии программа в университете Оберн для летних исследований финансирование PBR.

Materials

RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HEPES buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10mL Syringe BD Biosciences 301604
23-gauge needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

Riferimenti

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

Play Video

Citazione di questo articolo
Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

View Video