Изоляции и культуры клеток первичного эпикардиальной, производный от сердца человека взрослых и плода образцов
Summary
Epicardium играет решающую роль в развитии и ремонт сердца, предоставляя клетки и факторы роста к стенке миокарда. Здесь мы описываем метод культуры клеток человека первичной эпикардиальной который позволяет исследование и сравнение характеристик их развития и взрослых.
Abstract
Epicardium, слой эпителиальных клеток, охватывающих миокарда, играет важную роль во время развития сердца, а также в ответе ремонт сердца после ишемического повреждения. При активации, эпикардиальной клетки претерпевают процесс, известный как эпителиального мезенхимальных перехода (EMT) предоставлять клеток к регенерации миокарда. Кроме того epicardium вносит через секреции основных паракринными факторов. В полной мере оценить регенеративный потенциал epicardium, требуется модель клеток человека. Здесь мы приводим романа ячеечная модель культуры для получения первичных клеток эпикардиальной производных (EPDCs) от человека взрослых и плода сердечной ткани. Чтобы изолировать EPDCs, epicardium расчлененный извне сердце образца и перерабатывается в одну ячейку подвеска. Далее EPDCs покрытием и культивировали в EPDC среде, содержащей ALK ингибитор 5-киназы SB431542 для поддержания их эпителиального фенотип. EMT индуцируется стимуляции с TGFβ. Этот метод позволяет, в первый раз, изучение процесса человеческого эпикардиальной EMT в контролируемых условиях и облегчает набирает больше проницательности в secretome EPDCs, которые могут помочь регенерации сердца. Кроме того этот единообразный подход позволяет для прямого сравнения эпикардиальной поведения человека взрослых и плода.
Introduction
Epicardium, эпителиального пласта одной ячейки, что конверты сердца, имеет жизненно важное значение для развития сердечной и ремонт (обзор в Смитс et al. 1). вследствие порока развития, epicardium возникает от proepicardial орган, маленькая структура, расположенный на базе развивающихся сердца. Вокруг развития день E9.5 в мыши и 4 недели после зачатия в человека клетки начинают мигрировать из этой структуры цветная капуста и охватывают развивающихся миокарда2. Как только на одной эпителиальных клеток образуется слой, часть эпикардиальной клеток проходит эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT). В ходе EMT клетки теряют их эпителиального характеристики, такие как ячеек спайки и получить мезенхимальных фенотип, который дает им способность мигрировать в развивающихся миокарда. Сформированные эпикардиальной производных клетки (EPDCs) могут дифференцироваться в нескольких типов сердечных клеток, включая фибробласты, клетки гладких мышц и потенциально кардиомиоцитов и эндотелиальных клеток3, хотя дифференциация последних двух ячеек населения остается предметом обсуждения (обзор в Смитс и др. 4). Кроме того, epicardium обеспечивает поучительным паракринными сигналы в миокарде регулировать ее роста и васкуляризация5,6,,78. Многочисленные исследования показали, что нарушение эпикардиальной формирования приводит к пороков в сердечной мышцы9,10, сосудистую11и проведение системы12, подчеркивая основные вклад epicardium к формированию сердца.
Хотя в самом взрослых epicardium присутствует как спящие слой, он становится возобновлена после ишемии13. После травмы эпикардиальной реактивации резюмирует некоторые из процессов описал для сердца развития, включая распространение и EMT14, хотя и менее эффективно. Интересно хотя точный механизм не поняты, эпикардиальной вклад ремонт может быть улучшена путем обращения с, например, Thymosin β415 или изменение VEGF-А мРНК16, что приводит к улучшенное сердечной функция, после инфаркта миокарда. Epicardium поэтому считается интересный источник клеток для повышения внутреннего ремонта потерпевшего сердца.
Механизмы развития сердца часто изъятый во время травмы, хотя и в менее эффективным способом. Поисках эпикардиальной активаторы важно, что мы можем определить и сравнить на полную мощность плода и взрослых epicardium. Кроме того с терапевтической точки зрения, важно, что, помимо экспериментов на животных, мы расширить знания относительно реакции человеческого epicardium. Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и культуры взрослых и плода эпикардиальной производных клетки человека (EPDCs) в морфологии как эпителиальных клеток и побудить EMT. С этой моделью мы стремимся изучить и сравнить поведение взрослых и плода эпикардиальной клеток.
Основным преимуществом этого протокола является использование эпикардиальной материала человека, который не были тщательно изучены. Важно отметить, что описанные изоляции и клетки культуры протокол обеспечивает один единый метод для получения обоих EPDCs плода и взрослых булыжником, позволяя прямое сравнение между этими двумя клетки источниками. Кроме того поскольку epicardium изолирован, основанный на ее расположении, обеспечивается что клетки являются на самом деле epicardially производных17.
В то время как человека методы изоляции EPDC были созданы ранее, эти основном полагаются на протоколы нарост, где кусочки ткани, сердца или эпикардиальной покрыты на клетки культуры блюдо18,19. Этот подход таким образом выбирает специально для клетки, частично теряют их эпителиального фенотипом для миграции, и что более подвержены проходят самопроизвольно EMT. В текущем протоколе epicardium сначала обрабатывается в одну ячейку решение, которое позволяет изолированных EPDCs для поддержания их эпителия. Таким образом, этот метод обеспечивает твердых в vitro модель для изучения эпикардиальной EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем подробный протокол для изоляции и культуры первичной эпикардиальной клетки, полученные от человеческих сердцах взрослых и плода. Обширные характеристики этих клеток был ранее опубликованный17. Мы показали, что оба типы клеток можно сохранить как клетки …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддерживается организацией Нидерланды для научных исследований (НВО) (ВЕНИ 016.146.079) и LUMC исследовательских стипендий и AMS и Stichting Bontius LUMC (MJG).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
Riferimenti
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Biologia dello sviluppo. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
