मानव वयस्क और भ्रूण दिल नमूनों से व्युत्पंन प्राथमिक Epicardial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति
Summary
epicardium के विकास और कोशिकाओं और रोधगलन को विकास कारकों प्रदान करके दिल की मरंमत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यहां, हम संस्कृति मानव प्राथमिक epicardial कोशिकाओं है कि अध्ययन और उनके विकास और वयस्क विशेषताओं की तुलना में सक्षम बनाता है एक विधि का वर्णन ।
Abstract
epicardium, एक उपकला कोशिका परत मायोकार्डियम को कवर, हृदय विकास के दौरान एक आवश्यक भूमिका है, साथ ही कोरोनरी चोट के बाद दिल की मरम्मत प्रतिक्रिया में. जब सक्रिय, epicardial कोशिकाओं एक उपकला के रूप में जाना जाता प्रक्रिया से गुजरना mesenchymal संक्रमण (EMT) के लिए कोशिकाओं को चूकने मायोकार्डियम को प्रदान करने के लिए. इसके अलावा, epicardium आवश्यक paracrine कारकों के स्राव के माध्यम से योगदान देता है । पूरी तरह से epicardium की अपक्षयी क्षमता की सराहना करते हैं, एक मानव कोशिका मॉडल की आवश्यकता है । यहां हम मानव वयस्क और भ्रूण कार्डियक ऊतक से प्राथमिक epicardial व्युत्पंन कोशिकाओं (EPDCs) प्राप्त करने के लिए एक उपंयास सेल संस्कृति मॉडल रूपरेखा । EPDCs को अलग करने के लिए, epicardium दिल नमूना के बाहर से विच्छेदित है और एक एकल सेल निलंबन में कार्रवाई की । अगले, EPDCs चढ़ाया और EPDC ALK 5-कळेनासे अवरोधक SB431542 युक्त माध्यम में संस्कृति को अपनी उपकला phenotype बनाए रखने के लिए कर रहे हैं । EMT TGFβ के साथ उत्तेजना से प्रेरित है । इस विधि में सक्षम बनाता है, पहली बार के लिए, एक नियंत्रित सेटिंग में मानव epicardial EMT की प्रक्रिया का अध्ययन, और EPDCs के secretome में और अधिक अंतर्दृष्टि पाने की सुविधा है कि हृदय पुनर्जनन सहायता कर सकते हैं । इसके अलावा, इस वर्दी दृष्टिकोण मानव वयस्क और भ्रूण epicardial व्यवहार की प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
epicardium, एक एकल कोशिका उपकला परत कि लिफाफे दिल, हृदय विकास और मरंमत के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है (Smits एट अल में समीक्षा की. 1). विकास, epicardium proepicardial अंग से उठता है, एक छोटे से विकासशील दिल के आधार पर स्थित संरचना । विकास दिवस के आसपास माउस में 9.5 ई, और 4 सप्ताह के बाद मानव में गर्भाधान, कोशिकाओं को इस फूलगोभी संरचना से पलायन शुरू और विकासशील मायोकार्डियम2कवर । एक बार एक एकल उपकला कोशिका परत का गठन किया जाता है, epicardial कोशिकाओं के एक हिस्से उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT) से गुजरती है. EMT के दौरान, कोशिकाएं कोशिका-कोशिका आसंजन जैसे उनकी उपकला विशेषताओं को खो देती हैं और mesenchymal phenotype प्राप्त करती हैं जो उन्हें विकासशील मायोकार्डियम में माइग्रेट करने की क्षमता प्रदान करती हैं. गठित epicardial व्युत्पन्न कोशिकाओं (EPDCs) fibroblasts सहित कई हृदय कोशिका प्रकार में अंतर कर सकते हैं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, और संभावित cardiomyocytes और endothelial कोशिकाओं3, हालांकि उत्तरार्द्ध दो सेल के भेदभाव जनसंख्या बहस के अधीन रहता है (Smits एट अल में समीक्षा की । 4). इसके अलावा, epicardium अपने विकास और vascularization5,6,7,8को विनियमित करने के लिए मायोकार्डियम को शिक्षाप्रद paracrine संकेत प्रदान करता है । कई अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि बिगड़ा epicardial गठन हृदय मांसपेशी9,10, vasculature11, और आचरण प्रणाली12में विकासात्मक दोषों की ओर जाता है, आवश्यक पर बल दिल के गठन के लिए epicardium का योगदान ।
हालांकि वयस्क दिल में epicardium एक निष्क्रिय परत के रूप में मौजूद है, यह13ischemia पर सक्रिय हो जाता है । Epicardial रिएक्टिवेशन पोस्ट-इंजरी recapitulates, हृदय विकास के लिए वर्णित प्रक्रियाओं के कई, जिनमें प्रसार और EMT14, यद्यपि कम कुशलता से हैं । दिलचस्प है, हालांकि सटीक तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आता है, मरंमत के लिए epicardial योगदान के साथ उपचार द्वारा सुधार किया जा सकता है, जैसे, Thymosin β415 या संशोधित वीईजीएफ़-एक mRNA16, उन्नत कार्डियक में जिसके परिणामस्वरूप रोधगलन के बाद समारोह । epicardium इसलिए घायल दिल की मरंमत अंतर्जात बढ़ाने के लिए एक दिलचस्प सेल स्रोत माना जाता है ।
हृदय विकास के तंत्र अक्सर चोट के दौरान recapitulated हैं, हालांकि एक कम कुशल तरीके से । epicardial उत्प्रेरकों की खोज में, यह सर्वोपरि है कि हम निर्धारित करने और भ्रूण और वयस्क epicardium की पूरी क्षमता की तुलना कर सकते हैं । इसके अलावा, देखने के एक चिकित्सकीय बिंदु से, यह महत्वपूर्ण है कि, पशु प्रयोगों के अलावा, हम मानव epicardium की प्रतिक्रिया के बारे में ज्ञान का विस्तार । यहाँ, हम एक उपकला कोशिका की तरह आकृति विज्ञान में और EMT प्रेरित करने के लिए मानव वयस्क और भ्रूण epicardial व्युत्पन्न कोशिकाओं (EPDCs) को अलग और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन. इस मॉडल के साथ, हम का पता लगाने और वयस्क और भ्रूण epicardial सेल व्यवहार की तुलना उद्देश्य ।
इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ मानव epicardial सामग्री का उपयोग है, जिसका गहन अध्ययन नहीं किया गया है । महत्वपूर्ण बात, वर्णित आइसोलेशन और सेल कल्चर प्रोटोकॉल दोनों भ्रूण और वयस्क कॉबल EPDCs प्राप्त करने के लिए एक समान विधि प्रदान करता है, इन दो सेल सूत्रों के बीच एक सीधी तुलना को सक्षम करने. इसके अतिरिक्त, के बाद से epicardium अपने स्थान के आधार पर पृथक है, यह सुनिश्चित किया जाता है कि कोशिकाओं वास्तव में epicardially प्राप्त कर रहे है17।
जबकि मानव EPDC अलगाव तरीकों पहले स्थापित किया गया है, ये ज्यादातर वृद्धि प्रोटोकॉल पर निर्भर जहां हृदय या epicardial ऊतक के टुकड़े एक सेल संस्कृति डिश18,19पर चढ़ाया जाता है । इस दृष्टिकोण इस प्रकार की कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से चुनता है कि आंशिक रूप से उनके उपकला phenotype खो क्रम में माइग्रेट करने के लिए, और अधिक सहज EMT से गुजरना करने के लिए प्रवण हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल में, epicardium पहले एक एकल कोशिका समाधान जो अलग EPDCs अपनी उपकला राज्य को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है में संसाधित है. इस विधि इसलिए epicardial EMT अध्ययन करने के लिए एक ठोस इन विट्रो मॉडल प्रदान करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए अलग और संस्कृति प्राथमिक epicardial मानव वयस्क और भ्रूण दिल से प्राप्त की कोशिकाओं । इन कोशिकाओं के व्यापक लक्षण वर्णन पहले17प्रकाशित किया गया है । ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को नीदरलैंड के ऑर्गेनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (NWO) (वेणी 016.146.079) और एक LUMC रिसर्च फेलोशिप दोनों को एम्स, और LUMC Bontius Stichting (MJG) ने समर्थन दिया है.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
Riferimenti
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