O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano
Summary
O epicárdio desempenha um papel crucial no desenvolvimento e na reparação do coração, fornecendo células e fatores de crescimento da parede miocárdica. Aqui, descrevemos um método de cultura primária Epicárdica células de origem humana que permite o estudo e a comparação de suas características de adultas e de desenvolvimento.
Abstract
O epicárdio, uma camada de células epiteliais, cobrindo o miocárdio, tem um papel essencial durante o desenvolvimento cardíaco, bem como na resposta de reparação do coração após lesão isquêmica. Quando ativado, Epicárdica células passam por um processo conhecido como epiteliais de transição mesenquimal (EMT) para fornecer células para a regeneração do miocárdio. Além disso, o epicárdio contribui através da secreção de fatores essenciais parácrina. Para apreciar plenamente o potencial regenerativo do epicárdio, um modelo de célula humana é necessário. Aqui podemos delinear um modelo de cultura celular novela para derivar células derivadas Epicárdica primárias (EPDCs) de tecido cardíaco humano adulto e fetal. Para isolar EPDCs, o epicárdio é dissecado do lado de fora do espécime coração e transformado em uma suspensão de célula única. Em seguida, EPDCs são chapeados e cultivadas em meio de EPDC contendo o inibidor da 5-quinase ALK SB431542 para manter seu fenótipo epitelial. EMT é induzida pela estimulação com TGFβ. Este método permite, pela primeira vez, o estudo do processo de EMT Epicárdica humana em um ambiente controlado e facilita a ganhar mais conhecimento no secretome de EPDCs que pode ajudar na regeneração do coração. Além disso, esta abordagem uniforme permite a comparação direta do comportamento humano adulto e fetal Epicárdica.
Introduction
O epicárdio, uma camada epitelial de célula única que envelopes o coração, é de vital importância para o desenvolvimento cardíaco e reparação (revisto em Smits et al 1). desenvolvente, epicárdio surge a partir do órgão de proepicardial, uma pequena estrutura localizada na base do coração em desenvolvimento. Em torno do desenvolvimento dia E9.5 no rato e 4 semanas pós-concepção em humanos, células começam a migrar a partir desta estrutura de couve-flor e cubra o desenvolvimento do miocárdio2. Uma vez que é formada uma camada única de células epiteliais, uma parte das células Epicárdica sofre epitelial de transição mesenquimal (EMT). Durante EMT, células perdem suas características epiteliais, tais como aderências célula-célula e obter um fenótipo mesenquimal que lhes dá a capacidade de migrar para o miocárdio em desenvolvimento. As células derivadas Epicárdica formadas (EPDCs) podem se diferenciar em vários tipos de células cardíacas, incluindo fibroblastos, células musculares lisas e potencialmente cardiomyocytes e células endoteliais3, embora a diferenciação destes últimos dois celular as populações continua a ser objecto de debate (revisto em Smits et al 4). Além disso, o epicárdio fornece sinais de parácrina instrutivo para o miocárdio para regular o seu crescimento e vascularização5,6,7,8. Vários estudos têm demonstrado que a deficiente formação Epicárdica leva a defeitos no desenvolvimento de músculo cardíaco9,10, vasculatura11e condução sistema12, enfatizando o essencial contribuição do epicárdio para a formação do coração.
Embora no coração adulto epicárdio está presente como uma camada de dormente, ele torna-se reativado após isquemia13. Pós-lesão Epicárdica reativação recapitula a vários dos processos descritos para desenvolvimento cardíaco, incluindo proliferação e EMT14, embora menos eficientemente. Curiosamente, embora o mecanismo exato não é totalmente compreendido, a contribuição Epicárdica para reparar pode ser melhorada por tratamento com, por exemplo, Timosina β415 ou modificado de RNAm de VEGF-A16, resultando em cardíaco melhorou função após infarto do miocárdio. O epicárdio, portanto, é considerado uma interessante fonte de célula para realçar reparar endógena do coração ferido.
Mecanismos de desenvolvimento cardíaco são frequentemente instaurados durante a lesão, embora de forma menos eficiente. Em busca de ativadores epicárdica, é primordial que podemos determinar e comparar a capacidade total do epicárdio fetal e adulto. Além disso, do ponto de vista terapêutico, é importante que, além de experiências com animais, estendemos conhecimentos sobre a resposta do epicárdio humana. Aqui, descrevemos um método para isolar e cultura adultas e fetais Epicárdica derivadas células humanas (EPDCs) em uma célula epitelial–como morfologia e induzir EMT. Com este modelo, pretendemos explorar e comparar o comportamento de célula Epicárdica adulto e fetal.
A principal vantagem deste protocolo é o uso de material humano epicárdico, que não tem sido exaustivamente estudado. Importante, o protocolo de cultura de isolamento e celular descrito fornece um único método uniforme para derivar Ambos EPDCs godo fetal e adulto, permitindo uma comparação direta entre essas fontes de duas células. Além disso, desde que o epicárdio é isolado com base em sua localização, assegura-se que as células são na verdade epicardially derivada de17.
Embora métodos de isolamento humanos EPDC tenham sido criados anteriormente, estas principalmente dependem de protocolos de consequência natural, onde os pedaços de tecido cardíaco ou epicárdico são banhados em uma cela cultura prato18,19. Esta abordagem desse modo seleciona especificamente para as células que parcialmente perder seu fenótipo epitelial para migrar, e que são mais propensas a se submeter a EMT espontânea. No protocolo atual, o epicárdio é primeiro transformado em uma solução única célula que permite as EPDCs isolados manter seu estado epitelial. Este método fornece, portanto, um modelo sólido em vitro para estudar Epicárdica EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para isolar e cultura primárias Epicárdica células derivadas de corações humanos adultas e fetais. Extensa caracterização dessas células tem sido publicado anteriormente17. Mostramos que os dois tipos de células podem ser mantidos como células epiteliais de paralelepípedos, como quando cultivadas com o inibidor de quinase ALK5 SB431542. EMT é parte integrante da ativação epicárdico na vivo durante o desenvolvimento e a resposta pós-l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é suportada pela organização do Países Baixos para investigação científica (NWO) (VENI 016.146.079) e uma bolsa de pesquisa LUMC tanto para AMS e LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
Riferimenti
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Biologia dello sviluppo. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
