El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal
Summary
El epicardio desempeña un papel crucial en el desarrollo y la reparación del corazón células y factores de crecimiento para la pared miocardio. Aquí, describimos un método para las células epicárdicas primaria humanas cultura que permite el estudio y comparación de sus características de desarrollo y adultos.
Abstract
El epicardio, un capa de células epiteliales que cubre el miocardio, tiene un papel fundamental durante el desarrollo cardíaco, así como en la respuesta de reparación del corazón después de lesión isquémica. Cuando se activa, las células epicárdicas se someten a un proceso conocido como epitelial de transición mesenquimal (EMT) para proporcionar a las células para regenerar miocardio. Además, el epicardio contribuye mediante la secreción de factores paracrinos esencial. Para apreciar el potencial regenerativo del epicardio, se requiere un modelo de célula humana. Aquí esbozamos un modelo de cultura de célula novela para derivar las células derivadas epicárdicas primarias (EPDCs) del tejido cardiaco adulto y fetal humano. Para aislar EPDCs, el epicardio es disecado desde el exterior de la pieza de corazón y transformar en una suspensión unicelular. A continuación, EPDCs son plateados y cultivadas en medio de la CDEP que contiene el inhibidor de la 5-quinasa ALK SB431542 mantener su fenotipo epitelial. EMT es inducida por la estimulación con TGFβ. Este método permite, por primera vez, el estudio del proceso de EMT epicárdico humano en un ambiente controlado y facilita el obtener una visión más clara en el secretoma de EPDCs que puede ayudar a la regeneración del corazón. Además, este enfoque uniforme permite la comparación directa de la conducta humana adulta y fetal epicárdico.
Introduction
El epicardio, un capa epitelial unicelular que sobres el corazón, es de vital importancia para el desarrollo cardíaco y reparación (revisado en Smits et al. 1). retraso mental, el epicardio deriva el órgano proepicárdicas, una pequeña estructura situada en la base del corazón en desarrollo. Desarrollo día E9.5 en Concepción después de 4 semanas en ser humano y el ratón, las células comienzan a migrar desde esta estructura de coliflor y cubrir el desarrollo del miocardio2. Una vez que se forma una capa única de células epiteliales, una porción de las células epicárdicas sufre epitelial de transición mesenquimal (EMT). Durante la EMT, las células pierden sus características epiteliales, tales como adhesiones célula-célula y obtención un fenotipo mesenquimal que les da la capacidad de migrar en el miocardio en vías de desarrollo. Las células derivadas epicárdicas formadas (EPDCs) pueden distinguir en varios tipos de células cardiacas incluyendo fibroblastos, células musculares lisas y potencialmente cardiomiocitos y células endoteliales3, aunque la diferenciación de estos últimos dos celulares las poblaciones sigue siendo objeto de debate (revisado en Smits et al. 4). Además, el epicardio proporciona señales instructivas paracrina al miocardio para regular su crecimiento y vascularización5,6,7,8. Múltiples estudios han demostrado que formación epicárdica deteriorada conduce a defectos de desarrollo en músculo cardiaco9,10, vasculatura11y conducción sistema12, haciendo hincapié en lo esencial contribución de epicardio a la formación del corazón.
Aunque el epicardio está presente como una capa inactiva en el corazón adulto, se llega a ser reactivado a isquemia13. Después de la lesión epicárdica reactivación recapitulan varios de los procesos describen para el desarrollo cardíaco, incluyendo proliferación y14de la EMT, aunque menos eficientemente. Curiosamente, aunque el mecanismo exacto no se entiende completamente, la contribución epicárdica a reparar se puede mejorar mediante tratamiento con, por ejemplo, timosina β415 o modificado ARNm del VEGF-A16, dando por resultado cardiaco mejoró función después de infarto de miocardio. El epicardio, por tanto, se considera una fuente interesante de celular para mejorar la reparación endógena del corazón lesionado.
Mecanismos del desarrollo cardíaco a menudo son recapitulados durante la lesión, aunque de manera menos eficiente. En busca de activadores epicárdicos, es de suma importancia que podemos determinar y comparar la capacidad total de epicardio fetal y adulto. Por otra parte, desde un punto de vista terapéutico, es importante que, además de los experimentos con animales, ampliamos conocimientos sobre la respuesta del epicardio humana. Aquí, describimos un método para aislar y adulto y fetales epicárdicas derivado las células humanas (EPDCs) en una morfología epitelial-célula-como de la cultura y para inducir la EMT. Con este modelo, nuestro objetivo es explorar y comparar el comportamiento adulto y fetal la célula epicárdico.
La principal ventaja de este protocolo es el uso de material epicárdico humano, que no ha sido bien estudiado. Lo importante, el protocolo de cultivo aislamiento y celular descrito proporciona un método uniforme para derivar ambos EPDCs adoquín fetal y adulto, lo que permite una comparación directa entre estas fuentes de dos células. Además, desde el epicardio está aislado basado en su ubicación, se asegura que las células son realmente epicardially derivada17.
Mientras que previamente se han establecido métodos de aislamiento de DAPC humanos, estos en su mayoría dependen de protocolos de derivación donde se platean pedazos de tejido cardiaco o epicárdico en una célula cultura plato18,19. Este enfoque lo selecciona específicamente por células que pierden parcialmente su fenotipo epitelial para migrar, y que son más propensos a experimentar la EMT espontánea. En el protocolo actual, el epicardio se transforma primero en una solución única célula que permite el EPDCs aislados mantener su estado epitelial. Este método por lo tanto proporciona un modelo sólido en vitro para estudiar la EMT epicárdico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un protocolo detallado para aislar y la cultura primarias epicárdicas células derivadas de los corazones humanos adultos y fetales. Amplia caracterización de estas células ha sido previamente publicado17. Hemos demostrado que se pueden mantener ambos tipos de células como las células epiteliales de adoquines-como cuando se cultivan con el inhibidor de la cinasa del ALK5 SB431542. EMT es una parte integral de activación epicárdica en vivo durante el desarrollo y l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación es apoyada por la organización de países bajos para la investigación científica (NWO) (VENI 016.146.079) y una beca de investigación LUMC a AMS y Stichting LUMC de Bontius (MJG).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
Riferimenti
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