基于流式细胞仪的 Zika 病毒疗养血清测定登革热病毒的体外抗体依赖性
Summary
我们描述了一个简单和简单的协议, 以测量抗体依赖性增强感染的 Zika 病毒恢复血清使用登革热病毒报告病毒粒子。
Abstract
抗体依赖性增强感染已被证明在登革热病毒发病机制中发挥重要作用。传统的测定抗体或血清能力以增强不允许细胞系感染的方法, 依赖于在培养基中使用病毒输出, 然后用斑块化验来量化感染。最近, 这些化验已经检查了登革热病毒 (DENV) 感染的细胞系使用荧光标记抗体。这两种方法都限制了这些技术的广泛使用。在这里, 我们描述一个简单的体外试验, 使用登革病毒报告病毒微粒 (RVPs), 表达绿色荧光蛋白和 K562 细胞, 以检查抗体依赖性增强 (艾德) DENV 感染的血清, 从恒河猴获得猕猴感染 Zika 病毒后16周 (ZIKV)。这种技术是可靠的, 涉及对细胞的最小操纵, 不涉及使用活复制主管病毒, 并可以执行高吞吐量格式, 以获得定量读数使用流式细胞术。此外, 这种检测可以很容易地适应检查其他黄感染的抗体依赖增强 (艾德), 如黄热病病毒 (YFV), 日本马脑炎病毒 (JEEV), 西尼罗河病毒 (WNV) 等 RVPs 可用。建立测试、分析数据和解释结果的简便性使其对大多数实验室设置非常适合。
Introduction
抗体依赖性增强 (艾德) 感染是一个过程, 其中部分交叉反应抗体的反应, 由一个血清型的病毒增强吸收另一种血清型病毒, 导致增加病毒复制和病毒血症。艾德已广泛记录在登革热病毒 (DENV) 感染, 其中四主要血清型流行。在患者的一小部分, 艾德与登革热出血热 (DHF) 有关。我们最近表明, Zika 病毒 (ZIKV) 感染引起明显的 DENV 交叉反应抗体应答, 导致 DENV体外, 并可能有助于增强 DENV 病毒血症在体内 1,2. 抗体依赖性增强检测是评估抗体增强继发感染相关病毒能力的宝贵工具, 并为黄感染的发病机制提供有价值的见解, 并告知疫苗的研制。
这里描述的化验使用 DENV RVPs 和 K562 细胞通常不允许感染。RVPs 是结构上完整的复制不称职的 DENV 病毒粒子, 编码一个亚基因组绿色荧光蛋白 (GFP) 传代, 在一轮复制3后表示。因此, 感染 RVPs 的细胞荧光绿色, 可以通过流式细胞术或显微镜随时检测到。本试验中使用的 RVPs 是从商业来源获得的。但是, 它们可以生成针对其他病毒, 并用于本手稿中描述的化验。同时, K562 细胞是一种 FcγIII 受体表达的白血病细胞系, 与抗体 Fc 区结合, 并在抗体4,5的亚中和浓度存在时感染。
在调查严重登革热危险因素的研究中广泛使用了艾德测定法, 并描述了体外的机制6,7,8。在这里描述的艾德化验可以快速和容易地用来确定血清的能力, 以提高体外感染使用 RVPs 和流式细胞术, 与目前使用的其他化验相比, 这需要确定的斑块形成单位 (pfu) 在维罗细胞或抗体染色的感染细胞6,7,8,9,10,11, 这两个都是时间消耗和劳动力密集。
Protocol
Representative Results
Discussion
Flaviviruses, 如 DENV 和 ZIKV, 在其结构和非结构蛋白中都有明显的同源性, 它们产生的抗体相互相互反应13,14。这些交叉反应抗体反应已被证明, 以增强感染的体内和体外与异种血清或其他相关 flaviviruses1,2。交叉增强感染的潜力对疾病的管理和疫苗的开发有着重要的影响。
传统的…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
所述项目得到了来自卫生科学制服服务大学的资金的支持, JJM。本文所载的意见或断言是作者的私人观点, 不应被解释为官方的, 也不反映国防部、卫生科学系制服服务大学或美国任何其他机构的意见。政府。
WGV 进行了所有实验, 并对数据进行了分析;JJM 设计和监督研究;WGW 和 JJM 写了这篇论文。
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
Riferimenti
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