Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum
Summary
Wir beschreiben eine einfache und leichte Protokoll zur Messung der Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion durch Zika Virus genesenden Serum mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel.
Abstract
Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion hat sich gezeigt, eine wichtige Rolle in Dengue-virale Pathogenese zu spielen. Traditionelle Assays, die die Kapazität von Antikörpern oder Serum Infektion in unzulässige Zelllinien zu messen haben stützte sich auf mit viralen Ausgabe in den Medien, gefolgt von Plaque-Assays, um Infektion zu quantifizieren. Diese Tests haben in jüngerer Zeit, Dengue-Virus (DENV) Infektion in die Zell-Linien mit Gewebekulturen beschriftete Antikörper untersucht. Beide Ansätze haben Einschränkungen, die den weit verbreiteten Einsatz dieser Techniken einschränken. Hier beschreiben wir einen einfachen in Vitro Assay mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel (RVP), die Ausdrücken grün fluoreszierendes Protein und K562-Zellen zu Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der DENV Infektion mit Serum, das Rhesus entnommen wurde Makaken 16 Wochen nach der Infektion mit Zika-Virus (ZIKV). Diese Technik ist zuverlässig, beinhaltet minimale Manipulation von Zellen, beinhaltet jedoch nicht die Verwendung von live Replikation zuständigen Virus und in einem hohen Durchsatz-Format für eine quantitative Auslesen mit Durchflusszytometrie erhalten durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann dieser Assay leicht angepasst werden, um Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der andere Flavivirus Infektionen wie Gelbfieber-Virus (YFV), japanische Equine Enzephalitis-Virus (JEEV), West-Nil-Virus (WNV) etc., RVP vorliegen, zu untersuchen. Die einfache Einrichtung der Assay, Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse macht es sehr geeignet, um die meisten Labor-Einstellungen.
Introduction
Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der Infektion ist ein Prozess, wobei teilweise kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert durch einen Serotyp des Virus verbessert die Aufnahme von einem anderen Serotyp des Virus, was zu erhöhten Virusreplikation und Virämie. ADE wurde ausgiebig in Dengue-Virusinfektionen (DENV) dokumentiert, wo die vier wichtigsten Serotypen weit verbreitet sind. Bei einem Teil der Patienten ist ADE Dengue hämorrhagisches Fieber (DHF) zugeordnet. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Zika-Virus (ZIKV)-Infektion signifikant hohe DENV kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert, die ADE DENV in Vitro verursacht und wahrscheinlich dazu beigetragen, die Verbesserung der DENV Virämie in Vivo1 , 2. Antikörper-abhängige Verstärkung-Assays sind ein wertvolles Instrument zur Bewertung der Kapazität von Antikörpern gegen Sekundärinfektion mit verwandten Viren erweitern und wertvolle Einblicke in die Pathogenese der Flavivirus Infektionen und informieren die Entwicklung von Impfstoffen.
Der Test beschrieben verwendet hier DENV RVP zusammen mit K562-Zellen, die normalerweise unzulässig für Infektionen sind. RVP sind strukturell intakt Replikation inkompetenten DENV Viruspartikel, die ein Sub-genomische grün fluoreszierendes Protein (GFP) Replicon zu kodieren, die nach einer Runde Replikation3ausgedrückt wird. Als solche Zellen, die mit RVP infiziert fluoreszieren grün und leicht detektiert werden mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Die RVP in diesem Assay verwendet wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen. Sie können gegen andere Viren generiert und verwendet in der Probe in diesem Manuskript beschrieben. Unterdessen sind K562 Zellen einer FcγIII Rezeptor-exprimierenden Leukämie Zelllinie, die an die Fc-Region von Antikörper binden und im Beisein von Sub-Neutralisierung Konzentrationen von Antikörpern4,5infiziert werden.
ADE-Assays wurden ausgiebig in Studien zur Untersuchung der Risikofaktoren für schwere Dengue-Fieber und die Mechanismen der in-vitro- ADE abzugrenzen verwendet6,7,8. Der hier beschriebenen ADE-Assay schnell und einfach lässt sich die Kapazität des Serum zur Verbesserung von in-vitro- Infektion mit RVP und flow Cytometry, im Vergleich zu anderen Assays verwendet derzeit, die entweder erfordern die Bestimmung der Bildung von Plaque zu bestimmen Einheiten (Pfu) in Vero-Zellen oder Antikörper Färbung der infizierten Zellen6,7,8,9,10,11, beide zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind intensive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flaviviren wie DENV und ZIKV Teilen deutlichen Anzeichen Homologie in ihre strukturelle und nicht strukturelle Proteine, die Antikörper zu erzeugen, die mit einander13,14Kreuzreaktion. Diese kreuzreaktiven Antikörperantworten nachweislich zur Verbesserung der Infektion in Vivo und in Vitro mit einer heterologen Serotyp oder andere im Zusammenhang mit Flaviviren1,2. Kreuz zu verbessern,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das beschriebene Projekt wurde aus Mitteln der Sonstiges Services University of Health Sciences, JJM unterstützt. Meinungen oder Aussagen, die hierin enthaltenen sind die privaten, der Autoren und nicht um sein als offizielle oder reflektierenden die Aussicht auf das Department of Defense, Sonstiges Dienstleistungen University Health Sciences oder einer anderen Agentur der USA ausgelegt Regierung.
WGV alle Experimente durchgeführt und analysiert die Daten; JJM konzipiert und betreut die Studie; WGW und JJM, schrieb die Zeitung.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
Riferimenti
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