एक सरल प्रवाह Cytometry आधारित परख में निर्धारित करने के लिए इन विट्रो एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि डेंगू के वायरस का उपयोग Zika वायरस स्वास्थ्य लाभ सीरम
Summary
हम Zika वायरस स्वास्थ्य लाभ सीरम द्वारा संक्रमण के एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि को मापने के लिए एक सरल और आसान प्रोटोकॉल का वर्णन डेंगू वायरस रिपोर्टर वायरल कणों का उपयोग कर ।
Abstract
संक्रमण के एंटीबॉडी आश्रित बढोतरी को डेंगू वायरल रोगजनन में प्रमुख भूमिका निभाते दिखाया गया है । पारंपरिक परख कि एंटीबॉडी या सीरम की क्षमता को मापने के लिए अनुचित सेल लाइनों में संक्रमण को बढ़ाने के लिए पट्टिका परख के बाद मीडिया में वायरल उत्पादन का उपयोग करने पर भरोसा किया है संक्रमण । हाल ही में, इन परख फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी का उपयोग कर सेल लाइनों में डेंगू वायरस (देंव) संक्रमण की जांच की है । इन दोनों तरीकों सीमाएं है कि इन तकनीकों का व्यापक उपयोग सीमित है । यहां, हम इन विट्रो में एक सरल वर्णन डेंगू वायरस रिपोर्टर वायरल कणों (RVPs) का उपयोग कर कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन और K562 कोशिकाओं एक्सप्रेस एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि की जांच करने के लिए (ADE) देंव से प्राप्त किया गया था सीरम का उपयोग संक्रमण रीसस मकाक Zika वायरस (ZIKV) के साथ संक्रमण के बाद 16 सप्ताह. इस तकनीक विश्वसनीय है, कोशिकाओं के ंयूनतम हेरफेर शामिल है, जीना प्रतिकृति सक्षम वायरस का उपयोग शामिल नहीं है, और एक उच्च प्रवाह प्रारूप में किया जा सकता है एक मात्रात्मक readout प्रवाह cytometry का उपयोग कर पाने के लिए । इसके अतिरिक्त, इस परख को आसानी से एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (ADE) ऐसे पीत ज्वर वायरस (YFV), जापानी घोड़े इन्सेफेलाइटिस वायरस (JEEV), पश्चिम नील नदी वायरस (WNV) आदि जहां RVPs उपलब्ध है के रूप में अंय flavivirus संक्रमण के । ऊपर परख की स्थापना की आसानी, डेटा का विश्लेषण, और परिणाम की व्याख्या यह उच्च सबसे प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए उत्तरदाई बनाता है ।
Introduction
संक्रमण के एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि (ADE) एक प्रक्रिया है जिससे आंशिक रूप से पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी वायरस के एक सीरोटाइप द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाओं वायरस के एक अन्य सीरोटाइप के आगे बढ़ाती है, वृद्धि हुई वायरल प्रतिकृति और viremia के लिए अग्रणी. ADE में डेंगू वायरस (देंव) संक्रमण बड़े पैमाने पर प्रलेखित किया गया है जहां चार प्रमुख serotypes प्रचलित हैं । रोगियों के एक सबसेट में, ADE डेंगू रक्तस्रावी बुखार (DHF) के साथ जुड़ा हुआ है । हम हाल ही में दिखाया गया है कि Zika वायरस (ZIKV) संक्रमण देंव पार-प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के काफी उच्च स्तर प्रेरित है कि ADE के कारण देंव इन विट्रो में और संभावना vivo मेंदेंव viremia की वृद्धि करने के लिए योगदान1 , 2. एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि परख एक महत्वपूर्ण उपकरण के लिए एंटीबॉडी की क्षमता का आकलन करने के लिए संबंधित वायरस के साथ माध्यमिक संक्रमण बढ़ाने और flavivirus संक्रमण के रोगजनन में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर रहे है और सूचित टीकों का विकास ।
यहां वर्णित परख K562 कोशिकाओं है कि आम तौर पर संक्रमण के लिए अनुचित है के साथ साथ देंव RVPs का उपयोग करता है । RVPs संरचनात्मक रूप से बरकरार प्रतिकृति अक्षम देंव वायरल कण है कि एक उप सांकेतिक शब्दों में बदलना-जीनोमिक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) replicon कि प्रतिकृति के एक दौर के बाद व्यक्त किया जाता है3। जैसे, कोशिकाओं है कि RVPs fluoresce हरी से संक्रमित हो जाते हैं और आसानी से प्रवाह cytometry या माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर पाया जा सकता है. इस परख में प्रयुक्त RVPs वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया । वे, तथापि, अंय वायरस के खिलाफ उत्पंन किया जा सकता है और इस पांडुलिपि में वर्णित परख में इस्तेमाल किया । इस बीच, K562 कोशिकाओं एक FcγIII-रिसेप्टर-ल्यूकेमिया कोशिका लाइन कि एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र के लिए बाध्य व्यक्त कर रहे हैं और उप की उपस्थिति में संक्रमित हो जाते हैं-एंटीबॉडी4की सांद्रता बेअसर,5.
ADE परख गंभीर डेंगू के लिए जोखिम वाले कारकों की जांच और के तंत्र चित्रित करने के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है इन विट्रो ADE6,7,8. ADE परख यहां वर्णित जल्दी और आसानी से सीरम की क्षमता का निर्धारण करने के लिए इन विट्रो RVPs और प्रवाह cytometry का उपयोग कर संक्रमण में वृद्धि कर सकते हैं, के रूप में अंय परख वर्तमान में इस्तेमाल किया, जो या तो पट्टिका के निर्धारण की आवश्यकता की तुलना में वीरो कोशिकाओं में इकाइयों (pfu) या संक्रमित कोशिकाओं के एंटीबॉडी धुंधला6,7,8,9,10,11, जिनमें से दोनों समय लेने और परिश्रम कर रहे है गहन.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flaviviruses जैसे देंव और ZIKV दोनों अपने संरचनात्मक और गैर संरचनात्मक प्रोटीन है कि एंटीबॉडी कि पार-एक दूसरे के साथ प्रतिक्रिया13,14उत्पंन में समरूपता के महत्वपूर्ण सबूत साझा करें । इन क्रॉ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्णित परियोजना स्वास्थ्य विज्ञान के वर्दीधारी सेवा विश्वविद्यालय से JJM को निधियों द्वारा समर्थित किया गया था. राय या दावों निहित इस के साथ साथ लेखकों के निजी लोगों रहे है और सरकारी या रक्षा विभाग के विचारों को प्रतिबिंबित करने के लिए नहीं कर रहे हैं, वर्दीधारी सेवा स्वास्थ्य विज्ञान या अमेरिका के किसी अंय एजेंसी के विश्वविद्यालय सरकार.
WGV सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया और डेटा का विश्लेषण; JJM डिजाइन और अध्ययन की निगरानी; WGW और JJM ने पेपर लिखा ।
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
Riferimenti
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