En enkel flowcytometri basert analyse for å fastslå In Vitro antistoff avhengige forbedring av Dengue Virus benytter Zika Virus rekonvalesent Serum

Summary

Vi beskriver en enkel og enkel protokoll for å måle antistoff avhengige forbedring av infeksjon av Zika virus rekonvalesent serum ved bruk av Dengue virus Reporter viruspartikler.

Abstract

Antistoff avhengige forbedring av infeksjon har vist seg å spille en viktig rolle i Dengue virus patogenesen. Tradisjonelle analyser som måler kapasiteten i antistoffer eller serum å forbedre infeksjon i utillatelig cellelinjer avhengig med viral produksjon i media etterfulgt av plakk analyser for å kvantifisere infeksjon. Disse analyser har nylig undersøkt Dengue virus (DENV) infeksjon i cellelinjer med fluorescently merket antistoffer. Begge disse metodene har begrensninger som begrenser den utbredte bruken av disse teknikkene. Her beskriver vi en enkel i vitro analysen ved hjelp av Dengue virus reporter virus partikler (RVP’ene) som uttrykker grønne fluorescerende protein og K562 celler å undersøke antistoff avhengige ekstrautstyr (ADE) DENV infeksjon bruker serum som ble Hentet fra rhesus aper 16 uker etter Zika viruset (ZIKV). Denne teknikken er pålitelig, innebærer minimal manipulering av celler, involverer ikke bruk av live replikering kompetent virus og kan utføres i en høy gjennomstrømning format å få en kvantitativ avlesning ved hjelp av flowcytometri. I tillegg kan denne analysen enkelt tilpasses for å undersøke antistoff avhengige forbedring (ADE) av andre flavivirus infeksjoner som gulfeber virus (YFV), japansk Equine Encefalitt virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. hvor RVP’ene er tilgjengelig. Enkel å sette opp analysen, analysere data, og tolke resultatene gjør det svært mottakelig for de fleste laboratorium innstillinger.

Introduction

Antistoff avhengige ekstrautstyr (ADE) infeksjon er en prosess der delvis cross-reactive antistoff svar indusert av en serotype virus forbedrer opptaket av en annen serotype av viruset, fører til økt viral replikasjon og viremia. ADE har blitt grundig dokumentert i Dengue virus (DENV) infeksjoner der fire store serotyper er utbredt. Et delsett av pasienter er ADE forbundet med denguefeber hemoragisk (DHF). Vi har nylig vist at Zika-smitte (ZIKV) indusert betydelig høye nivåer av DENV cross-reactive antistoff svar som forårsaket ADE av DENV i vitro og trolig bidratt til styrking av DENV viremia i vivo^{1 , 2}. antistoff avhengige ekstrautstyr analyser er et verdifullt verktøy å vurdere kapasitet av antistoffer til å forbedre sekundær infeksjon med i slekt viruser og gi verdifull innsikt i patogenesen av flavivirus infeksjoner og informere den utvikling av vaksiner.

Analysen beskrevet bruker her DENV RVP’ene sammen med K562 celler som er normalt utillatelig til infeksjon. RVP’ene er strukturelt intakt replikering inkompetente DENV virus partikler som kode en sub-genomisk grønne fluorescerende protein (GFP) replicon som uttrykkes etter én enkelt runde med replikering³. Som sådan, celler som blir smittet med RVP’ene fluoresce grønn og kan lett oppdaget flowcytometri eller mikroskopi. RVP’er brukes i denne analysen var oppnådd fra kommersielle kilder. De kan imidlertid være mot andre virus som brukes i analysen beskrevet i dette manuskriptet. I mellomtiden er K562 cellene en FcγIII-reseptor-uttrykke leukemi cellen linje som binder til Fc regionen antistoffer og bli smittet i nærvær av sub nøytralisere konsentrasjoner av antistoff^4,5.

ADE analyser har vært mye brukt i studier undersøker risikofaktorer for alvorlig dengue og avgrense mekanismer for i vitro ADE^6,7,8. ADE analysen beskrevet her kan raskt og enkelt brukes til å bestemme kapasiteten av serum å forbedre i vitro infeksjon med RVP’ene og flow cytometri, sammenlignet med andre analyser brukes i dag, som krever enten fastsettelse av plakk dannes enheter (pfu) i Vero celler og antistoff farging av infiserte celler^{6,7,8,9,10,11}, begge er tidkrevende og Ap intensiv.

Protocol

Serumprøver brukes til å vise protokollen beskrevet her Hentet fra rhesus aper som ligger og stelt i samsvar med lokale, statlige og føderale politikk i en forening for vurdering og akkreditering av laboratoriet Animal Care International (AAALAC)-akkreditert anlegget. Alle dyreforsøk blir gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité og prøver ble kjøpt gjennom en vev deler protokollen. 1. dag 1 Merk: Utføre alle trinnene som beskrives…

Representative Results

Sera fra 4 rhesus aper var samlet 16 uker etter smitte med ZIKV og testet for deres potensial til å øke DENV-1, 2, 3 og 4 infeksjon i K562 celler. Dyrene hadde topp viremia ~ 1 x 105 eksemplarer av ZIKV RNA/mL plasma dag 3 etter infeksjon som falt til nivåer som var under grensen for påvisning av 7 dager etter smitte. Ingen viremia ble oppdaget i plasma på 16 uker etter smitte. Deretter RVP analysen ble utført og de innsamlede dataene ble analysert, som beskrevet i over p…

Discussion

Flaviviruses som DENV og ZIKV dele betydelige bevis for homologi i begge deres strukturelle og ikke-strukturell proteiner som genererer antistoffer som cross-react med hverandre^13,14. Disse cross-reactive antistoff svar har vist seg å forbedre infeksjon både i vivo og i vitro en heterologous serotype eller andre relaterte flaviviruses^1,2. Potensial til å krysse forbedre infeksjon har …

Materials

DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348