Implantation de la canule dans la Magna de Cisterna de rongeurs
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une canulation cisterna magna (MCC), une façon mini-invasive pour livrer les traceurs, les substrats et les molécules de signalisation dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Combiné avec différentes modalités d’imagerie, CMc permet glymphatic système et évaluation dynamique CSF, ainsi que livraison de cerveau à l’échelle des divers composés.
Abstract
Canulation de Cisterna magna (CMc) est une procédure simple qui permet de rejoindre directement le liquide céphalo-rachidien (LCR) sans endommager le crâne ou le parenchyme du cerveau du dispositif. Chez les rongeurs anesthésiés, l’exposition de la dure-mère par dissection non tranchante des muscles de la nuque permet l’insertion d’une canule dans la cisterna magna (CM). La canule, composée par une fine aiguille biseautée ou borosilicaté capillaire, est reliée par un tube en polyéthylène (PE) à une seringue. À l’aide d’un pousse-seringue, molécules peuvent ensuite être injectés au taux contrôlés directement dans le CM, ce qui est en continuité avec l’espace sous-arachnoïdien. De l’espace sous-arachnoïdien, nous pouvons retracer les flux CSF par flot dans l’espace périvasculaire autour des artérioles pénétrantes, où se fait l’échange soluté avec le liquide interstitiel (ISF). CMc peut être effectuée pour les injections aiguës immédiatement après la chirurgie, ou pour l’implantation chronique, avec injection ultérieure dans anesthésiés ou éveillé, se déplaçant librement des rongeurs. Quantification de la répartition du traceur dans le parenchyme du cerveau peut être effectuée par épifluorescence, microscopie 2 photons et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), en fonction des propriétés physico-chimiques des molécules injectées. Ainsi, CMc en collaboration avec différentes techniques d’imagerie offre un outil puissant pour l’évaluation de la glymphatic système et la dynamique de la CSF et la fonction. En outre, le CMc peut être utilisé comme un conduit pour une livraison rapide à l’échelle du cerveau de signalisation des molécules et des substrats métaboliques qui ne pouvaient pas autrement traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE).
Introduction
Le liquide céphalorachidien (LCR) baigne le système nerveux central (CNS) dans le système ventriculaire et le long de l’espace sous-arachnoïdien, un espace défini anatomiquement dans continuum avec les ventricules, qui entoure le cerveau et la moelle épinière. Une des fonctions principales du FSC est de fournir un itinéraire pour la compensation des métabolites et des solutés du parenchyme du cerveau. Dédouanement est facilitée via le glymphatic récemment découvert système1, le cerveau analogique au système lymphatique périphérique. Ici, nous décrivons et discuter de la cisterna magna une canulation (MCC), une méthode mini-invasive pour la prestation directe de molécules dans le LCR. CMc est la principale méthode pour l’étude de la fonction glymphatic. En outre, CMc peut également être appliquée pour l’étude de la dynamique de la CSF et pour une livraison rapide, le cerveau à l’échelle des molécules perméable de barrière (BBB) non-hémato encéphalique dans le parenchyme du cerveau, le long de l’espace périvasculaire.
Le CMc exploite les principes physiologiques de la dynamique de mouvement de CSF à travers le système nerveux central pour livrer des molécules de traceur marqué ou de médicaments dans l’espace rempli de CSF de la cisterna magna (CM). Molécules sont injectées dans une canule implantée dans le revêtement membrane durale atlanto-occipitale, que les molécules cm sont ensuite transportés par flux en vrac CSF dans le parenchyme du cerveau via l’ espace de paravascular1. Agent traceur ou contraste injecté par l’intermédiaire de la CMc suit le mouvement du FSC, qui permet l’évaluation du mouvement de la CSF et afflux de glymphatic par la quantification des niveaux d’intensité des molécules marquées qui pénètrent dans le parenchyme du cerveau. CMc est compatible avec les différentes techniques d’imagerie, y compris épifluorescence, 2 photons microscopie et imagerie de résonance magnétique (IRM). En outre, cette évaluation peut être effectuée aussi bien in vivo ou ex vivo. Ce qui est important, CMc permet la visualisation du système glymphatic sous anesthésie ou pendant le sommeil naturel, ainsi que chez des animaux éveillés, librement mobiles.
La technique du CMc peut être utilisée pour étudier les différents aspects de la dynamique des fluides dans le LCR, mais s’est avéré particulièrement utile pour étudier le système de glymphatic. Glymphatic activité lecteurs le flot du LCR dans l’espace périartériels via les voies d’eau aquaporin-4 (AQP-4), qui sont attachés au maximum dans la membrane des astrocytes vasculaire habillage endfeet. Le flot permet l’échange de la CSF et le liquide interstitiel (ISF) dans le parenchyme du cerveau. CSF/ISF contenant les solutés et déchets métaboliques est ensuite prélevé le parenchyme du cerveau via le périveineuse espace2,3. En fin de compte, CSF/ISF atteint la périphérie via les vaisseaux lymphatiques dural décrit récemment4,5. Le système glymphatic a été montré indispensable lors du dédouanement de métabolites déchets nocifs tels que les β-amyloïde2. En outre, glymphatic dégagement est altérée dans le vieillissement6, après le traumatisme cérébral lésion7et dans des modèles animaux de diabète8 et9de la maladie d’Alzheimer. Glymphatic activité est notamment dépendent, montrant une activité sensiblement plus élevée pendant le sommeil ou l’anesthésie en comparaison de l’éveil1de l’État. En effet, les jeunes animaux anesthésiés présentent la plus forte activité de glymphatic. Ainsi, experimental quantification de l’activité glymphatic est essentielle lorsque l’on étudie son rôle dans la santé et la maladie.
Plusieurs études ont porté sur la dynamique de CSF et son échange avec le liquide interstitiel (ISF) dans le parenchyme du cerveau. Cependant, les méthodes par lesquelles les molécules marquées sont livrés sont plutôt envahissantes, déclenchement des lésions cérébrales parenchyme et les changements dans la pression intracrânienne (PIC) (voir revue de10). Quelques exemples sont intraventriculaires ou injections intraparenchymateuses impliquent la craniotomie ou forage d’une bavure le trou dans le crâne. Ces procédures ont démontré qu’alter ICP, perturbant ainsi la fonction glymphatic2. Aussi, ces méthodes invasives induisent astrogliosis et augmentent l’immunoréactivité AQP-4 dans la zone de parenchyme endommagée du cerveau et de ses environs11,12. Comme les astrocytes et AQP-4 sont des éléments clés du système glymphatic, le CMc est la méthode de choix pour ses études. Les principaux avantages de CMc par rapport à des procédures plus invasives sont le maintien d’un parenchyme crâne et le cerveau intact, en évitant les altérations de l’ICP et astrogliosis, respectivement. Ainsi, CMc en collaboration avec différents outils d’imagerie ouvre un large éventail de possibilités d’étudier non seulement le système de glymphatic, mais aussi la dynamique et de mécanismes de débit des fluides dans l’homéostasie, ainsi que dans des modèles animaux de maladies neurologiques.
La procédure de canulation (CMc) cisterna magna permet un accès facile et direct à du liquide céphalo-rachidien (LCR). En injectant des molécules différentes (p. ex. des traceurs fluorescents, les agents de contraste MRI), l’expérimentateur peut suivre leur circulation à l’intérieur du compartiment de la CSF et évaluer l’activité du système glymphatic. Le protocole suivant décrit les deux MCC aiguë, d’injections, immédiatement après la chirurgie et l’implantation chronique de la canule, dans lequel l’animal récupère de l’approche chirurgicale pour une injection ultérieure. La différence la plus importante entre l’implantation aiguë et chronique, c’est que l’implantation chronique permet l’étude de l’activité de la glymphatic chez les souris éveillés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté un protocole qui décrit une procédure détaillée pour une canulation cisterna magna (CMc), qui offre une méthode simple pour livrer des molécules marquées dans le compartiment de la CSF. CMc permet la visualisation ultérieure de la dynamique de CSF, aussi bien in vivo et ex vivo, en utilisant différentes modalités d’imagerie ou histologie.
Un des principaux avantages de la technique de CMc réside dans son accès direct à l’espace sous-arac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Novo Nordisk Foundation et la National Institute of Neurological Disorders et l’accident vasculaire cérébral, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. et Mustapha-R sont bénéficiaires d’une bourse de recherche postdoctorale et une bourse de doctorat de la Fondation de Lundbeck, respectivement.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
Riferimenti
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
