Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks
Summary
Intraspinal Injektion von Rekombinase abhängigen recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) kann verwendet werden, um jeden genetisch gekennzeichneten Zelltyp im Rückenmark zu manipulieren. Hier beschreiben wir, wie Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks lumbale transduzieren. Diese Technik ermöglicht funktionale Verhör des Subtyps manipulierten Neuron.
Abstract
Gezielte Manipulation der Wirbelsäule neuronalen Subpopulationen wurde vor allem durch zwei unterschiedliche Methoden erreicht: 1) intersektionale Genetik, wobei doppelte oder dreifache transgenen Mäusen erzeugt sind, um selektiv Ausdruck eines Reporters oder Effektor zu erreichen gen (z.B.aus der Rosa26-Locus) in der gewünschten spinale Bevölkerung. (2) Intraspinal Injektion von Cre-abhängige recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV); Hier werden das Rückenmark von Mäusen auszudrücken Cre-Rekombinase in die gewünschte neuronalen Subpopulation Cre-abhängige AAV-Vektoren, die Codierung für die Reporter oder Effektor gen Wahl injiziert. Dieses Protokoll beschreibt, wie Cre-abhängige rAAV Vektoren erzeugen und wie Sie transduzieren Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks lumbale Segmente L3-L5 mit rAAVs. Als der lumbalen Wirbelsäule Segmente L3-L5 sind die peripheren sensorischen Neuronen, die sensorische Informationen aus der Hintergliedmaßen übertragen innerviert, werden spontanes Verhalten und Reaktionen auf sensorische Prüfungen auf die Megalosauridae ipsilateral zur Injektion Seite angewendet analysiert, um die Funktion der manipulierten Neuronen in sensorischen Verarbeitung zu befragen. Wir liefern Beispiele dafür, wie diese Technik verwendet werden kann, um genetisch analysieren Teilmengen von der spinalen Neuronen definiert. Die wichtigsten Vorteile der Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in Cre Transgene Mäuse im Vergleich zu klassischen Reporter Maus-induzierte Transgene Ausdruck sind die folgenden: 1) verschiedene Cre-abhängige rAAVs Codierung verschiedene Reporter oder Effektor-Proteine kann sein in einer einzelnen Cre transgene Linie überwinden somit die Notwendigkeit, mehrere mehrere Transgene Maus Linien schaffen injiziert. (2) Intraspinal Injektion beschränkt Manipulation der Cre exprimierenden Zellen an der Injektionsstelle und auf die Zeit nach der Injektion. Die wichtigsten Nachteile sind: 1) Reporter-Gen-Expression von rAAVs ist variabler. (2) Operation ist erforderlich, um die spinalen Neuronen des Interesses transduzieren. Welche der beiden Methoden besser geeignet ist, hängt von der Neuron Bevölkerung und Forschung Frage angegangen werden.
Introduction
Die dorsale Rückenmark ist wichtig für den Informationsaustausch zwischen der Peripherie des Körpers und des Gehirns. Sensorische Reize wie Hitze, Kälte, tippen, oder Schmerzreize werden durch spezialisierte peripheren Nervenzellen, die diese Informationen an Neuronen des Rückenmarks Hinterhorn vermitteln erkannt. Hier, ein komplexes Netzwerk von exzitatorischen und inhibitorischen Interneuronen moduliert und schließlich Relais sensorische Informationen über spinale Projektion Neuronen zu supraspinalen Standorten1,2. Die Berechnungen von Rückenmark durchgeführten inter- und Projektion Neuronen gate sensorische Informationen, so bestimmen, welche Informationen unterdrückt oder mit welcher Intensität weitergeleitet. Änderungen bei der Integration der sensorischen Reize, wie eine veränderte Balance zwischen Hemmung und Erregung, können sensorische Funktionsstörungen wie Überempfindlichkeit oder Allodynie (schmerzhafte Empfindungen nach der Regel schmerzhafte Stimulation) verursachen. Diese Änderungen werden gedacht, um die zugrunde liegende Ursache der verschiedenen chronischen Schmerzen3,4Staaten. So, spinale Schaltungen sind von großer Bedeutung in der sensorischen Verarbeitung und damit in der Wahrnehmung der Umwelt eines Organismus und selbst. Mit dem jüngsten aufkommen und Kombination von molekularen, genetischen und chirurgische Techniken, mit denen die präzise Manipulation von genetisch identifizierten spinale Neuronen Subpopulationen, beginnen Wissenschaftler jetzt zu verstehen, die zugrunde liegende Rückenmark Schaltungen verantwortlich für die Verarbeitung von verschiedenen sinnesmodalitäten.
Intraspinal Injektion von rAAV in Wildtyp oder Transgene Mäuse trug wesentlich zum Verständnis der Funktion von bestimmten Teilmengen der spinalen Neuronen5,6,7, , Manipulation und Analyse 8 , 9 , 10 , 11. diese Technik ermöglicht die Lieferung von Marker-Proteine (z. B. GFP / GFP Fusionsproteine), Reporter Proteine (z. B. GCaMP) oder Effektor-Proteine (z. B. bakterielle Toxine, Channelrhodopsin oder pharmakogenetischen Rezeptoren) in einer räumlich eingeschränkten Weise spinale Neuronen. Lokale Injektion von Cre-abhängigen rAAVs in transgenen Mäusen, die mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase in eine bestimmte Teilmenge der spinalen Neuronen ermöglicht die spezifische Analyse der entsprechenden neuronalen Bevölkerung. Wir haben diese Technik zu beschriften, Abtragen, hemmen oder aktivieren spinale glycinergen Neuronen, die beweisen, dass sie sind ein wesentlicher Bestandteil der spinalen Tor Steuerung Schmerzen und Jucken Übertragung7beschäftigt. In diesen Experimenten aktiviert intraspinal Injektion von Cre-abhängige rAAV in GlyT2::Cre Mäusen die selektive Manipulation von glycinergen Neuronen in der Lendenwirbelsäule Rückenmark. Dadurch kann gleichzeitige Manipulation der supraspinalen Schaltungen, die kritisch für das Überleben des Tieres glycinergen Neuronen enthalten vermieden werden.
Während eine intraspinal Injektion von rAAVs Infektion auf der Website der Injektion beschränkt, kann virale Transduktion auftreten, nicht nur in lokalen Neuronen, sondern auch in Neuronen, die an der Injektionsstelle über axonalen Projektionen anschließen. Letzteres dient oft zur Spur CNS Bereichen Bereitstellung von neuronalen Input zu einem bestimmten Kern in das Gehirn. Die Infektion der axonalen Projektionen kann, jedoch auch eine verwirrende Faktor sein, wenn an einer bestimmten Stelle eine definierte Population von Neuronen untersucht werden soll. Um diese Probleme anzugehen, haben wir vor kurzem durchgeführt, eine umfassende Analyse der AAV-Serotypen und Expressionskassetten Serotypen und Promotoren, die verwendet werden können, zu minimieren oder maximieren retrograde Transduktion zu identifizieren. Im Rahmen dieser spezifischen Forschung in spinaler Schaltungen analysierten wir die Fähigkeit der verschiedenen Serotypen und Promotoren, doppelthebel transduzieren Neuronen in den Dorsal Root Ganglien (DRG), der rostral ventromedialen Medulla (RVM) und somatosensorischen Cortex 12. die Technik in diesem Protokoll beschriebenen kann daher verwendet werden, um spinale Neuronen an der Injektionsstelle zu analysieren oder Projektion Neuronen zu analysieren, die Beiträge zu den injizierten Seite des Rückenmarks liefern. In dem hier beschriebenen Protokoll werden drei Injektionen von rAAV in die linke Seite des lumbalen Rückenmarks durchgeführt, um die Transduktion von Neuronen in den drei Lendenwirbel (L3-L5) zu ermöglichen. Die L3-L5-Segmente erhalten die meisten sensorischen Input von ipsilateral Megalosauridae an der Injektionsstelle. Wir zeigen, dass funktionale Manipulation von genetisch beschrifteten Neuronen im L3-L5 ausreichend robuste Verhaltensänderungen hervorrufen so funktional Nachweis für die Funktion der Schaltung solch eines genetisch beschrifteten Neuron-Untertyps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intraspinal Injektion von Flugabwehrpanzer kann eine leistungsfähige Technik in einem Forschungslabor ermöglicht die Analyse der Wirbelsäule Zellen mit einer hohen zeitlichen und räumlichen Lösung geworden. Dieses Protokoll ermöglicht die Signalweiterleitung der drei wichtigsten wirbelsäulensegmente sensorischen Neuronen erweitern ihre peripheren Axone, die Megalosauridae innerviert. Transducing drei Segmente produziert robuste und reproduzierbare Verhaltensdaten. Es ermöglicht auch ein größerer sensorischen Be…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die großzügige Unterstützung dieser Arbeit Hanns Ulrich Zeilhofer. Hendrik Wildner wurde von Olga Mayenfisch-Stiftung unterstützt. Wir danken Carmen Birchmeier für den Lmx1b-Antikörper.
Materials
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) | Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
Riferimenti
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
