בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה
Summary
כאן נציג של השיטה הניסיונית כדי לבחון את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.
Abstract
פלסמידים multicopy נפוצים מאוד אאוקריוטים אך תפקידם באבולוציה חיידקי נשאר ממעטים להבין. לאחרונה הראינו כי העלייה במספר עותק גנטי בכל תא שסופקו על-ידי פלסמידים multicopy עלול להאיץ את האבולוציה של גנים פלסמיד מקודד. בעבודה זו, אנו מציגים מערכת ניסויית לבחון את היכולת של פלסמידים multicopy כדי לקדם את ג’ין האבולוציה. באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית פשוטה, ואנחנו נבנה מערכת מודל שבו שניתן להוסיף של גנים עמידות לאנטיביוטיקה Escherichia coli MG1655, הכרומוזום או על פלסמיד multicopy. אנו משתמשים בגישה ניסויית האבולוציה כדי להפיץ זנים שונים תחת הגדלת ריכוזים של אנטיביוטיקה, אנו מודדים את ההישרדות של אוכלוסיות חיידקים לאורך זמן. הבחירה של המולקולה לאנטיביוטיקה ואת הגן ההתנגדות היא הגן יכול להתייעץ רק התנגדות באמצעות הרכישה של מוטציות. גישה זו “הצלה אבולוציונית” מספק שיטה פשוטה כדי לבחון את הפוטנציאל של פלסמידים multicopy לקדם הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה. בשלב הבא של מערכת ניסויית, מאופיינים הבסיסים מולקולרית של עמידות לאנטיביוטיקה. כדי לזהות מוטציות אחראי על הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה אנו משתמשים עמוק רצפי DNA של דגימות המתקבל באוכלוסיות שלמות, שיבוטים. לבסוף, כדי לאשר את התפקיד של מוטציות בגן שנבחנה, אנחנו לשחזר אותם על רקע הורים ובדוק את ההתנגדות פנוטיפ של זנים וכתוצאה מכך.
Introduction
עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים תהיה בעיה בריאות ור1. ברמה הבסיסית, ההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים פתוגניים היא דוגמא פשוטה של אבולוציה על ידי הברירה הטבעית2,3. במילים פשוטות, השימוש באנטיביוטיקה יוצר מבחר זנים עמידים. בעיה מרכזיים בביולוגיה אבולוציונית, לכן היא להבין את הגורמים המשפיעים על היכולת של אוכלוסיות חיידקים לפתח עמידות לאנטיביוטיקה. מבחר ניסויים הופיעו בתור כלי רב עוצמה כדי לחקור את הביולוגיה האבולוציונית של חיידקים, שדה זה הפיק מדהים תובנות מגוון רחב של בעיות אבולוציונית-4,–5,–6. באבולוציה ניסיוני, אוכלוסיות חיידקים יזומות של זן הורים יחיד באופן סדרתי passaged בתנאים מגבילים והמוגדרים. חלק מוטציות להתרחש במהלך הצמיחה של תרבויות אלה להגדיל את כושר חיידקי, אלה מופצים דרך התרבויות על ידי הברירה הטבעית. במהלך הניסוי, דגימות של האוכלוסיות נשמרים מעת לעת cryogenically כדי ליצור שאינם הולכים ומתפתחים קפוא מאובנים רשומה. מספר רחב של גישות יכול לשמש כדי לאפיין המתפתחת אוכלוסיות חיידקים, אבל שתי השיטות הנפוצות ביותר הם מבחני כושר, המודדים את היכולת של החיידקים מפותחת כדי להתחרות נגד אבות מרוחק, רצף הגנום כולו, זה המשמש לזיהוי לשינויים גנטיים הסתגלות כונן זה. בעקבות עבודתו החלוצית על ידי ריצ’ארד לנסקי עמיתים7,8, כבר הגישה סטנדרטי באבולוציה ניסיוני לאתגר מספר קטן יחסית של אוכלוסיות שכפל (בדרך כלל < 10) עם הסתגלות חדשה אתגר סביבתי, כגון מקורות פחמן חדשים, טמפרטורה או של phage דורסנית.
זיהומים הנגרמים על ידי חיידקים עמידים בפני אנטיביוטיקה הופכים בעיה גדולה ההתנגדות היא גבוהה מספיק שזה לא אפשרי להגדיל בריכוזים אנטיביוטי לרמות קטלני ברקמות החולה. קלינאים מעוניינים ולכן מה מאפשר לחיידקים לפתח עמידות מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה כי הם מעל סף הריכוז לאנטיביוטיקה, העצירה קליניים. איך ללמוד זאת השפעול? אם מספר קטן של אוכלוסיות חיידקים מאותגרים עם מינון גבוה של אנטיביוטיקה, כמו לנסקי-סגנון ניסוי, ואז התוצאה הסבירה ביותר היא כי האנטיביוטיקה לנהוג כל האוכלוסיות הכחדה. במקביל, אם המנה של אנטיביוטיקה המשמשת נמוכה, להלן ריכוז מעכבות מינימלי (MIC) של המתח הורים, אז זה לא סביר כי אוכלוסיות חיידקים תתפתח רמות הרלוונטית קלינית של התנגדות, במיוחד אם ההתנגדות נושא עלות גדולה. אחד פשרה בין שני תרחישים אלה היא להשתמש10,119,ניסוי “הצלה אבולוציונית”. בגישה זו, מספר גדול מאוד של תרבויות (בדרך כלל > 40) נאלץ להתמודד עם מנות של אנטיביוטיקה להגדיל לאורך זמן, בדרך כלל על-ידי הכפלת ריכוז אנטיביוטיקה כל יום12. סימן ההיכר של הניסוי הזה היא כי כל התושבים לא להתפתח עמידות מוגברת תהיה מונעת הכחדה. רוב אוכלוסיות מאותגרים בדרך זו תהיה מונעת שנכחדו, אך מיעוט קטן יישמר על ידי מתפתח ברמות גבוהות של התנגדות. בנייר זה, אנו מראים איך עיצוב ניסיוני זה יכול לשמש כדי לחקור את תרומתו פלסמיד multicopy האבולוציה של עמידות.
חיידקים לרכוש עמידות לאנטיביוטיקה דרך שני מסלולים עיקריים, מוטציות כרומוזומליות, רכישת ניידת מרכיבים גנטיים, בעיקר פלסמידים13. פלסמידים לשחק תפקיד מפתח האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה, כי הם מסוגלים להעביר גנים עמידות בין חיידקים על ידי ההטיה14,15. פלסמידים ניתן לחלק לשתי קבוצות על פי גודל וביולוגיה שלהם: “קטן”, עם העתק גבוהה מספר לכל תא החיידק, “גדול”, עם נמוך להעתיק16,מספר17. התפקיד של פלסמידים גדול באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה תועד בהרחבה כי הם כוללים פלסמידים conjugative, אשר הם מניעי מפתח של הפצת ההתנגדות עמידות רב בקרב חיידקים15. פלסמידים multicopy קטנים גם הם נפוצים מאוד חיידקים17,18, הם לעיתים קרובות קוד עבור גנים עמידות לאנטיביוטיקה19. עם זאת, תפקידו של פלסמידים multicopy קטן של התפתחות של עמידות לאנטיביוטיקה נחקרה פחותה.
עבודה אחרונים, אנחנו הציע כי פלסמידים multicopy עלול להאיץ את האבולוציה של הגנים שהם נושאים על ידי הגדלת גנים מוטציה המחירים עקב מספר עותק גנטי גבוה יותר לכל תא12. באמצעות מדגם ניסיוני עם זן e. coli MG1655 הגן β לקטמאז בלהTEM-1 זה הוצג כי פלסמידים multicopy האצת הקצב של הופעת מוטציות TEM-1 היוועצות התנגדות הדור השלישי צפלוספורין ceftazidime. תוצאות אלו ציינו כי פלסמידים multicopy עשוי לשחק תפקיד חשוב באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.
כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של השיטה פיתחנו לחקור את multicopy בתיווך פלסמיד האבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה. בשיטה זו יש שלושה שלבים שונים: הראשון, החדרת הגן שנבחנה על פלסמיד multicopy או הכרומוזום של החיידק המארח. שנית, שימוש ניסיוני האבולוציה (הצלה אבולוציונית) כדי להעריך את הפוטנציאל של זנים שונים כדי להתאים הלחץ הסלקטיבי. והשלישי, קביעת הבסיס המולקולרי שבבסיס בתיווך פלסמיד האבולוציה באמצעות DNA רצף, שיחזור של מוטציות חשד בנפרד גנוטיפ ההורים.
בסופו של דבר, למרות הפרוטוקול המתואר כאן תוכננה לחקור את התפתחות עמידות לאנטיביוטיקה, אפשר להתווכח כי שיטה זו יכול להיות שימושי בדרך כלל לנתח את האבולוציה של חידושים נרכשה על ידי מוטציות בכל multicopy פלסמיד מקודד ג’ין.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול חדש המשלב ביולוגיה מולקולרית, האבולוציה ניסיוני and רצפי DNA עמוק שנועד לחקור את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. למרות פרוטוקול זה משלב טכניקות מתחומים שונים, כל השיטות נדרש לפתח אותו פשוטים, ניתן לבצע במעבדה למיקרוביולוגיה רגיל. השלב?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי דה אינסטיטוטו סאלוד Carlos III (תוכנית Estatal דה אני + D + אני 2013-2016): מעניק CP15-00012 PI16-00860, CIBER (CB06/02/0053), שיתוף מימנה הקרן אזורי אירופה פיתוח ‘ דרך להשיג אירופה”(ERDF). ג’אי נתמך על-ידי התוכנית Atracción דה talento של ממשלת האזור של מדריד (2016-T1/ביו-1105) ואני + D Excelencia של הספרדים Ministerio דה Economía, תעשייה y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM נתמך על-ידי מלגת Servet מיגל דה אינסטיטוטו סאלוד Carlos III (MS15/00012) שיתוף הממומן על ידי הקרן החברתית האירופאית “השקעה בעתיד שלך” (ESF) ו ERDF.
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
Riferimenti
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
- Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
- Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
- Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
- Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
- San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
- Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
- Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
- Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
- San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
- Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d’Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
- Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
- . . Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , (2009).
- Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
- Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
- Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
- Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).
