Testing Multicopy plasmider rolle i utviklingen av antibiotikaresistens
Summary
Her presenterer vi en eksperimentell metode for å teste multicopy plasmider rolle i utviklingen av antibiotikaresistens.
Abstract
Multicopy plasmider er svært rikelig i prokaryoter, men deres rolle i bakteriell utviklingen fortsatt dårlig forstått. Vi har nylig viste at økningen i genet kopi tall per celle fra multicopy plasmider kunne akselerere utviklingen av plasmider-kodet gener. I dette arbeidet presenterer vi en eksperimentell system for å teste muligheten for multicopy plasmider å fremme genet evolusjon. Bruke enkel molekylærbiologi metoder, bygget vi et modellsystem der en antibiotikaresistens genet kan settes inn i Escherichia coli MG1655, i kromosomet eller på en multicopy plasmider. Vi bruker en eksperimentell utviklingen tilnærming overføres de ulike stammene under økende konsentrasjoner av antibiotika og vi måle overlevelse av bakteriell befolkninger over tid. Valg av antibiotika molekylet og motstand genet er slik at genet kan bare tildele motstand gjennom oppkjøpet av mutasjoner. Denne “evolusjonære redde” gir en enkel metode for å teste potensialet i multicopy plasmider å fremme oppkjøpet av antibiotikaresistens. I neste trinn av eksperimentelle kjennetegnes molekylær baser av antibiotikaresistens. For å identifisere mutasjoner ansvarlig for anskaffelsen av antibiotikaresistens bruker vi dyp DNA sekvensering av prøver innhentet fra hele befolkninger og kloner. Til slutt, for å bekrefte rollen mutasjoner i genet under studien, vi rekonstruere dem i foreldrenes bakgrunnen og teste motstand fenotypen av de resulterende stammene.
Introduction
Antibiotikaresistens i bakterier er store helsemessige problem1. På et grunnleggende nivå er spredning av antibiotikaresistens i patogene bakterier et enkelt eksempel på evolusjon ved naturlig utvalg2,3. Enkelt sagt, genererer bruk av antibiotika valg for resistente bakteriestammer. Et sentralt problem i evolusjonsbiologi, er derfor å forstå faktorene som påvirker evnen til bakteriell bestander å utvikle resistens mot antibiotika. Utvalg eksperimenter har dukket opp som et svært kraftig verktøy for å undersøke evolusjonsbiologi av bakterier, og dette feltet har produsert utrolige innsikt i en rekke evolusjonære problemer4,5,6. I eksperimentelle evolusjon, er bakteriell bestander startet fra en enkelt foreldrenes stamme serielt passaged under definerte og strengt kontrollert. Noen av mutasjoner som oppstår under veksten av disse kulturene øke bakteriell fitness, og disse spres gjennom kulturer ved naturlig utvalg. Under eksperimentet beholdes regelmessig cryogenically prøver av befolkningen for å opprette en ikke-utvikling frosne fossil posten. Et bredt antall tilnærminger kan brukes til å karakterisere utvikling bakteriell befolkninger, men de to vanligste metodene er fitness analyser, som måler evnen av utviklet bakterier for å konkurrere mot deres fjerne forfedre og hele genomet sekvensering, som er brukes til å identifisere genetiske endringer som stasjonen tilpasning. Etter pionerarbeid av Richard Lenski og kolleger7,8, standard tilnærmingen i eksperimentell utvikling har vært å utfordre et relativt lite antall Repliker populasjoner (vanligvis < 10) med å tilpasse seg en ny miljøbestemte utfordringen, som nye karbon kilder, temperatur eller en ROV phage.
Infeksjoner forårsaket av antibiotika resistente bakterier blir et stort problem når motstand er høy nok til at det ikke er mulig å øke antibiotikumet konsentrasjonene dødelige nivåer i pasienten vev. Klinikere er derfor interessert i hva gjør bakterier utvikle seg mot høye doser av antibiotika som er over denne terskelen antibiotika konsentrasjon, klinisk stoppunktet. Hvordan å studere dette eksperimentelt? Hvis et lite antall bakteriell populasjoner er utfordret med en høy dose av antibiotika, som en Lenski-stil er eksperimentet, så mest sannsynlig utfall at antibiotikaet vil drive alle befolkningen til utryddelse. Samtidig, hvis dosen av antibiotika som brukes er lav, under den minimale inhibitoriske konsentrasjonen (MIC) av foreldrenes belastningen, er det usannsynlig at bakteriell befolkningen vil utvikle seg klinisk relevante nivåer av motstand, særlig hvis motstand har en stor kostnad. En kompromiss mellom disse to scenariene er å bruke en «evolusjonære redde» experiment9,10,11. I denne tilnærmingen, et stort antall kulturer (vanligvis > 40) blir utfordret med doser av antibiotika som øker over tid, vanligvis ved å doble antibiotika konsentrasjon hver dag12. Kjennetegnet med dette eksperimentet er at en befolkning som ikke utvikles økt vil bli drevet til utryddelse. De fleste populasjoner som er utfordret på denne måten vil bli drevet utdødd, men en liten minoritet beholdes ved utvikler høye nivåer av motstand. I dette papiret viser vi hvordan denne eksperimentell design kan brukes å undersøke multicopy plasmider bidrag til utviklingen av motstand.
Bakterier erverve resistens mot antibiotika gjennom to viktigste ruter, chromosomal mutasjoner og oppkjøpet av mobile genetiske elementer, hovedsakelig plasmider13. Plasmider spille en nøkkelrolle i utviklingen av antibiotikaresistens fordi de er i stand til å overføre motstand gener mellom bakterier ved Bøyning14,15. Plasmider kan deles inn i to grupper i henhold til deres størrelse og biologi: “små”, med høy kopi nummer per bakterielle celler og “stor”, med lav kopiere nummer16,17. Rollen til store plasmider i utviklingen av antibiotikumet motstand har blitt grundig dokumentert fordi de inneholder konjugerbart plasmider, som viktige drivere av formidling av motstand og multi motstand blant bakterier15. Små multicopy plasmider er også svært vanlig bakterier17,18, og de koden ofte for antibiotikaresistens gener19. Men har rollen som små multicopy plasmider i utviklingen av antibiotikumet motstand vært studert i mindre grad.
I en nylig arbeid foreslått vi at multicopy plasmider kunne akselerere utviklingen av gener de bærer ved å øke gen mutasjon priser på grunn av høyere genet kopi per celle12. Bruke en eksperimentell modell med E. coli belastning MG1655 og β-lactamase gene blaTEM-1 ble det vist at multicopy plasmider akselerert frekvensen av utseendet på TEM-1 mutasjoner overdragelse motstand mot den tredje generasjonen cephalosporin ceftazidime. Disse resultatene indikerte at multicopy plasmider kan spille en viktig rolle i utviklingen av antibiotikaresistens.
Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av metoden vi har utviklet å undersøke multicopy plasmider-mediert utviklingen av antibiotikaresistens. Denne metoden har tre ulike trinn: først, innsetting av genet under studien i en multicopy plasmider eller kromosomet av verten bakterier. Andre bruk av eksperimentelle evolusjon (evolusjonære redning) å vurdere potensialet i forskjellige stammene til å tilpasse seg seleksjonspress. Og tredje, bestemme molekylær grunnlaget underliggende plasmider-mediert utviklingen med DNA sekvensering og rekonstruere mistenkt mutasjoner individuelt i foreldrenes genotype.
Til slutt, selv om protokollen beskrevet her ble utformet å undersøke utviklingen av antibiotikaresistens, man kan hevde at denne metoden kunne vanligvis nyttig å analysere utviklingen av innovasjoner kjøpt av mutasjoner i alle multicopy plasmider-kodet genet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer en ny protokoll kombinerer molekylærbiologi, eksperimentelle evolusjon og dyp DNA sekvensering utformet å undersøke rollen multicopy plasmider i utviklingen av antibiotikaresistens i bakterier. Selv om denne protokollen kombinerer teknikker fra ulike felt, alle metoder å utvikle den er enkel, og kan utføres i en vanlig mikrobiologi. De viktigste trinnene i protokollen er sannsynligvis byggingen av modellen systemet stammer og gjenoppbygging av mutasjoner observert etter eksperimentelle utviklingen (so…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av i Instituto de Salud Carlos III (planlegge Estatal de jeg + D + jeg 2013-2016): gir CP15-00012, PI16-00860 og CIBER (CB06/02/0053), delfinansiert av European utvikling regionale Fund ” en måte å oppnå Europa ” (ERDF). JAE støttes av Atracción de talento programmet av regjeringen i regionen Madrid (2016-T1/BIO-1105) og jeg + D Excelencia av den spanske Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM støttes av et Miguel Servet fellesskap fra Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) co-finansiert av The European Social Fund “Investering i fremtiden” (ESF) og ERDF.
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
Riferimenti
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
- Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
- Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
- Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
- Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
- San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
- Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
- Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
- Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
- San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
- Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d’Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
- Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
- . . Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , (2009).
- Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
- Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
- Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
- Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).
