बँटवारा के दौरान गुणसूत्र अलगाव की लाइव सेल इमेजिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक आसान और सुविधाजनक विधि लेबल और Histone2B-GFP BacMam 2.0 लेबल और एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग कर mitotic कोशिकाओं में रहते गुणसूत्रों कल्पना ।
Abstract
गुणसूत्रों मज़बूती से होना चाहिए और समान रूप से mitotic कोशिका विभाजन के दौरान बेटी कोशिकाओं में अलग । गुणसूत्र अलगाव की निष्ठा धुरी विधानसभा चौकी (सैक) शामिल है कि कई तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है । सैक एक जटिल प्रतिक्रिया प्रणाली है कि बँटवारा के माध्यम से एक सेल प्रगति की रोकथाम के लिए जिंमेदार है जब तक सभी गुणसूत्र kinetochores धुरी microtubules से जुड़े है का हिस्सा है । गुणसूत्र विश्र्व और असामान्य गुणसूत्र पृथक्करण शिथिल कोशिका चक्र नियंत्रण चौकियों का एक संकेतक है और विभाजन कोशिकाओं की जीनोमिक स्थिरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । थैली के विनियमन गुणसूत्र अलगाव के दौरान त्रुटियों के संचय के माध्यम से एक घातक सेल में एक सामांय कोशिका के परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं । थैली के कार्यांवयन और kinetochore परिसर के गठन कसकर kinases और फॉस्फेट जैसे प्रोटीन फॉस्फेट 2a (PP2A) के बीच बातचीत के द्वारा विनियमित रहे हैं । यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण fibroblasts चूहों कि PP2A-B56γ विनियामक उपइकाई के एक नॉकआउट था से पृथक में विश्र्व गुणसूत्रों के लाइव सेल इमेजिंग का वर्णन । यह विधि अन्य कोशिका चक्र नियंत्रण इमेजिंग तकनीकों जैसे फ्लो cytometry या immunocytochemistry की कमियों को काबू करती है जो केवल गुणसूत्रों के गतिशील spatiotemporal दृश्य के बजाय एक कोशिका cytokinesis स्थिति का स्नैपशॉट प्रदान करती हैं बँटवारा के दौरान.
Introduction
निंनलिखित प्रोटोकॉल में, हम एक सुविधाजनक विधि का वर्णन करने के लिए माउस भ्रूण fibroblasts में सेल चक्र के दौरान गुणसूत्र अलगाव और mitotic प्रगति कल्पना हिस्टोन बी-GFP, BacMam 2.0 लेबलिंग और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग कर ।
सेल चक्र नियंत्रण चौकियों गुणसूत्र अलगाव की निगरानी और सेल 1,2,3की आनुवंशिक अखंडता के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । गलत अलग गुणसूत्रों के संचय aneuploidy है, जो सबसे ठोस ट्यूमर की एक बानगी है नेतृत्व कर सकते है 4। इसलिए, विश्र्व गुणसूत्रों का पता लगाने के लिए गुणसूत्र अस्थिरता का अध्ययन करने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन के लिए जीना गुणसूत्र अलगाव और गुणसूत्र विश्र्व कल्पना लेकिन mCherry की पीढ़ी-टैग या H2B-GFP टैग प्रोटीन जीन वितरण और आणविक जीवविज्ञान के पर्याप्त ज्ञान की आवश्यकता है प्रयोग किया जा सकता है 5। यहां हम CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0 एजेंट के उपयोग का वर्णन, इसके बाद सीएल-एचबी regent कहा जाता है, सादगी की खातिर । इस रिएजेंट तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह वेक्टर गुणवत्ता और अखंडता के बारे में चिंताओं को समाप्त । इसके अलावा, इस एजेंट संभावित हानिकारक उपचार या लिपिड और डाई लोडिंग रसायनों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । पारंपरिक फ्लोरोसेंट लेबल के विपरीत, सीएल एचबी regent समारोह के स्वतंत्र रूप से दाग (यानी, झिल्ली क्षमता) । सीएल एचबी regent बस कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए रातोंरात गर्मी । सीएल एचबी regent स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिकृति नहीं है और सुरक्षा के स्तर (बीएसएल) 1 प्रयोगशाला सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस क्षणिक अभिकर्मक अप करने के लिए 5 दिनों के लिए रातोंरात मशीन के बाद पता लगाया जा सकता, पर्याप्त समय के लिए सबसे गतिशील सेलुलर विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए ।
वैकल्पिक रूप से, गुणसूत्र विषमताओं का अध्ययन विभिन्न तकनीकों जैसे प्रवाह cytometry, immunohistochemistry या प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (मछली) 6द्वारा किया जा सकता है । फ्लो cytometry aneuploidy अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो डीएनए सामग्री और कोशिका चक्र में कोशिकाओं के चरण के आधार पर मापा जा सकता है. हालांकि प्रवाह cytometry aneuploidy मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह गुणसूत्र एमआईएस-पृथक्करण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है । मछली और immunohistochemistry तकनीक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करने के लिए डीएनए या गुणसूत्रों को बांध । जबकि इन तकनीकों कोशिकाओं की आबादी की स्थिति का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, वे रहते सेल इमेजिंग जिससे किसी भी विशिष्ट कोशिकाओं में cytokinesis के spatiotemporal दृश्य के माध्यम से प्राप्त जानकारी समय की अवधि के बाद लापता की अनुमति नहीं है ।
इस प्रोटोकॉल को विश्र्व गुणसूत्रों या गुणसूत्र एमआईएस-अलगाव nocodazole इलाज माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) PP2A-B56γ-चूहों से पृथक में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके बाद के संस्करण आवेदन के अलावा, इस प्रोटोकॉल को लेबल और विभिंन प्रकार के सेल जो कोशिका चक्र विनियमन या ट्यूमर कोशिकाओं में गुणसूत्र अस्थिरता का अध्ययन किया जा सकता है में गुणसूत्र अलगाव कल्पना करने के लिए एक सरल उपकरण प्रदान करता है । इसके अलावा, यह भी विभिंन दवा उपचार की वजह से गुणसूत्र अस्थिरता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या जीन दस्तक के प्रभाव का अध्ययन बाहर गुणसूत्र गलत अलगाव में जिसके परिणामस्वरूप ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सही गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने के लिए सेल चक्र नियंत्रण चौकियों aneuploidy और सेल परिवर्तन 1,2,3को रोकनेके। वर्तमान अध्ययन में, हमने पाया कि PP2A की निष्क्रियता-B56γ एक कमजोर ध…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम dr. गुओ-Chiuan त्रिशंकु और बहुमूल्य टिप्पणी है कि पांडुलिपि में सुधार के लिए डॉ भरतकुमार जोशी का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
Riferimenti
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