유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징
Summary
이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.
Abstract
염색체 해야 안정적이 고 균일 하 게 분리 되어 딸 세포에 mitotic 세포 분열 동안. 염색체 분리의 충실도 스핀 들 어셈블리 검사점 (SAC)을 포함 하는 여러 메커니즘을 통해 제어 됩니다. SAC 모든 염색체 kinetochores microtubules 스핀 들에 첨부 하지 않으면 세포 유사 분열 진행의 예방에 대 한 책임은 복잡 한 피드백 시스템의 일부입니다. 염색체 지체 및 비정상적인 염색체 분리 역 기능 세포 주기 통제 검문소의 표시기 이며 셀 분할의 게놈 안정성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. SAC의 규제 완화는 염색체 분리 중 오류의 축적을 통해 악성 세포로 정상 세포의 변화에 발생할 수 있습니다. SAC의 구현 및 복잡 한 kinetochore의 형성 단단히 kinases와 단백질 인산 가수분해 효소 2A 등 인산 가수분해 효소 사이 상호 작용에 의해 규제 됩니다 (PP2A). 이 프로토콜 마우스 미 발달 섬유 아 세포 했다 PP2A B56γ 규제 소 단위의 녹아웃 쥐에서 고립에서 염색체를 후행의 라이브 셀 이미징을 설명 합니다. 이 방법은 다른 세포 주기 제어 이미징 기술 cytometry 또는 immunocytochemistry 같은 염색체의 동적 spatiotemporal 시각화 대신 셀 cytokinesis 상태 스냅숏을 제공의 단점을 극복 동안 유사 분열.
Introduction
다음 프로토콜에서 우리 염색체 분리 및 마우스 미 발달 섬유 아 세포 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0 라벨 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여에서 세포 주기 동안 mitotic 진행을 시각화 하는 편리한 방법을 설명 합니다.
세포 주기 통제 검문소 염색체 분리를 모니터링 하 고 셀 1,2,3의 유전 무결성의 유지 관리에 중요 한 역할. 미 분리 된 염색체의 이수성, 가장 단단한 종양 4의 특징은 발생할 수 있습니다. 따라서, 후행 염색체의 염색체 불안정성을 공부 하는 방법으로 사용할 수 있습니다.
붙일 표시 또는 라이브 염색체 분리를 시각화 하는 데 사용 하 고 mCherry 태그의 생성 하지만 후행 염색체 단백질 수 태그 H2B GFP 단백질 유전자 전달 및 분자 생물학 5의 상당한 지식이 필요 합니다. 여기는 CL-HB는 리 젠 트, 편의 위해이 전화 CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 시 약의 사용에 설명 합니다. 이 시는 즉시 사용할 수 있습니다 하 고 따라서 벡터 품질 및 무결성에 대 한 우려를 제거 합니다. 또한,이 시는 잠재적으로 유해한 치료 또는 지질 및 염료 선적 화학 물질의 사용을 필요 하지 않습니다. 기존의 형광 라벨, 달리 CL-HB 리 젠 트 기능에 독립적으로 얼룩 (즉., 막 잠재력). CL HB 리 젠 트를 단순히 셀에 추가 하 고 단백질 식 밤새 껏 알을 품 수 수 있습니다. CL HB 섭정 포유류 세포에서 복제 하지 않습니다 그리고 biosafety 수준 (BSL) 1 실험실 설정에서 사용할 수 있습니다. 또한, 가장 역동적인 세포 분석을 수행 하 후 최대 5 일까지 충분 한 시간 동안 야간 보육이 과도 transfection은 감지할 수 있습니다.
또는, 염색체 이상이 cytometry, immunohistochemistry 또는 형광 제자리 교 잡 (물고기) 6등 다양 한 기법에 의해 공부 될 수 있었다. Cytometry는 이수성, 측정 될 수 있는 DNA 콘텐츠 및 세포 주기 세포의 단계에 따라 공부를 사용할 수 있습니다. Cytometry 이수성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만 그것은 염색체 미 분리에 정보를 제공 하지 않습니다. 물고기와 immunohistochemistry 기술 DNA 또는 염색체에 바인딩할 형광 프로브를 사용 합니다. 이러한 기술은 세포의 인구 상태 스냅숏을 제공, 그들은 라이브 셀 이미징 함으로써 특정 셀 시간의 기간 동안 다음에 cytokinesis spatiotemporal 시각화를 통해 얻은 정보를 누락을 허용 하지 않습니다.
이 프로토콜은 지체 염색체 또는 염색체 미 분리 취급 하는 nocodazole 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에 PP2A-B56γ-마우스에서 분리 연구 하 사용 되었다. 응용 프로그램 위에 이외에,이 프로토콜 레이블 및 세포 주기 규칙을 공부 하는 데 사용할 수 있는 다양 한 셀 형식에 염색체 분리 또는 종양 세포의 염색체 불안정을 시각화 하는 간단한 도구를 제공 합니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 다양 한 약물 치료에 의해 발생 하는 염색체 불안정을 공부 하거나 유전자 염색체 미 분리의 결과로 밖으로 노크의 효과 연구.
Protocol
Representative Results
Discussion
정확한 염색체 분리를 보장 하는 세포 주기 통제 검문소 방지 이수성 및 셀 변환 1,2,3. 현재 연구에서 우리는 PP2A B56γ의 그 비활성화 발견 약화 스핀 들 어셈블리 검사점 귀착되 었 다. 라이브 셀 이미징을 사용 하 여 nocodazole 9PP2A B56γ MEFs 유사 분열 동안 염색체 미 분리 처리를 관찰할 수 있었습니다.
<p class=…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 박사 Guo Chiuan 웅와 박사 Bharatkumar 조시 원고를 개선 하는 소중한 의견에 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
Riferimenti
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