체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

Summary

이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

Abstract

체 관 부 및 식물 sap 먹이 곤충 침략 작물과 식량 작물을 손상 하는 과정에서 영양소를 검색 하는 과일의 무결성. Hemipteran 곤충 체 관 부 수액에 먹이로 작물을 손상 하는 식물의 경제적으로 상당한 해충의 숫자에 대 한 계정. 갈색 marmorated 악취 버그 (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae)와 아시아 감귤 류 psyllid (ACP), Diaphorina citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae)는 북미 지역에서 도입 hemipteran 해충 어디 그들은 그들은 실내 집계 때 고부가가치 전문, 행, 및 주식 작물 및 감귤 류 과일의 침략 농업 유해물으로 귀찮은 해충 있습니다. 많은 종에서 살충제 저항 해충 관리 전략의 대체 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이중 가닥 RNA (dsRNA)-중재 RNA 간섭 (RNAi)는 해충의 관리를 위한 공구로 잠재적인 응용 프로그램을 기능 게놈 연구에 대 한 메커니즘을 입을 유전자. 것 합성된 dsRNA 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)은 동종 제시 하는 내 생 RNA의 저하를 통해 매우 효율적인 유전자 침묵 하는 것을 실행할 수 있습니다. 효과적이 고 환경으로 사용 RNAi 분자 biopesticides biocontrol hemipteran 곤충의 대 한 먹이 통해 dsRNAs 비보에 전달을 해야합니다. 여기 곤충 dsRNA의 납품을 위한 방법 제시: 침수로 녹색 콩으로 dsRNA의 로드 하 고 섭취를 통해 구두 전달 유전자 특정 dsRNA의 흡수. 우리는 또한 비-유전자 변형 식물 배달 방법을 사용 하 여 잎 스프레이, 루트 물 약, 트렁크 주사 뿐만 아니라 찰 흙과 립, 모두의 dsRNA의 지속적인된 출시에 필수적인 수 있습니다 설명 했습니다. 구두로 섭취 dsRNA에 의해 효율적인 배달 타겟된 유전자, 청소년 호르몬 산 O-methyltransferase 등 (JHAMT)와 vitellogenin (Vg)의 표현에 상당한 감소를 유도 하는 효과적인 복용량으로 확인 됐다. 이러한 혁신적인 방법 해충 관리에 대 한 환경 문제를 극복 하 고 작물 보호에 사용 하는 dsRNA의 납품에 대 한 전략을 나타냅니다.

Introduction

Hemipteran 곤충 높은 인구 증가 달성 하 여 식물에 질병을 확산 그들의 능력의 agriculturebecause의 경제적으로 가장 중요 한 해충의 일부를 구성. BMSB, H. halys 찾을, 1996¹에 보고 된 첫 번째 보이 질와 아시아 (중국, 대만, 한국, 그리고 일본)에서 알 렌 타운, 펜실베이니아에 서반구에 실수로 도입 된 침입 해충 이다. 그것의 소개부터 BMSB Mid-atlantic (DE, MD, 펜 실바 니 아, 뉴저지, 버지니아, 그리고 웨스트 버지니아), 뿐만 아니라 캐나다, 유럽, 가장 높은 인구가 43 개 주에서 감지 되었습니다 하 고 농업²에 잠재적인 위협을 나타냅니다. Polyphagous 해충으로 BMSB 사과, 포도, 관 상용 식물, 씨앗, 콩, 작물과 옥수수 등 고부가가치 작물을 포함 하 여 약 300 확인 된 식물 호스트 손상을 선동 수 있습니다. 피해는 어디 동물 피어 호스트 작물 영양분을 혈관 조직^2,3에서 액세스 하는 바늘 같은 stylet와 lacerate 및 플러시 라고 먹이의 모드 때문에 주로 발생 합니다. BMSB 학교 등 생활 지역에 거주지를 찾을 수 있습니다 그들은 실내 해충 이기도 하 고가을 겨울²집. 화학 물질 및 aeroallergens BMSB 발표 과일 자르기 근로자에서 불법 알레르기 반응으로 보고 되었다. BMSB 또한 접촉 피부염, 결막염, 그리고 민감한 개인^4,5비 염 알레르기 질환에 기여할 수 있습니다. 또 다른 hemipteran 곤충, ACP, D. citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae), 감귤 류 과일의 심각한 해충 이며 Huanglongbing (HLB), 더 잘 알려진 원인 체 관 부-제한 된 박테리아 (Candidatus Liberibacter asiaticus)를 전송 감귤 류 녹화 질병^6,7로. HLB 중국 남부에서 처음 알려졌다 고 40 다른 아시아, 아프리카, 오세아니아, 한국 및 북미 국가⁷확산 하고있다. 감귤 류 녹화는 경제 및 재정 손실 때문에 감귤 류의 과일 손실; 위협 세계적인 문제 따라서, ACP의 관리는 방지 하 고 HLB 제어 매우 중요 간주 됩니다.

이러한 해충의 효과적인 제어를 위한 조치는 일반적으로 비교적 짧은 화학 살충제의 응용 프로그램 살 필요 합니다. 화학 살충제 제어 전략 종종 안전 환경 관리 전략 부족 또는 유해물 인구^8,9농약 저항으로 인해 민감성을 감소. 따라서, 분자 biopesticides 가진 유해물의 생물학 통제는 잠재적인 대안 이다, 하지만 그것의 사용은 세계적으로 겸손, 남아 및 parasitoids (예를 들어, Trisolcus 나무)의 다양 한 종 자연 생물으로도 효과적일 수 있습니다. 제어 합니다. RNAi 분자 biopesticides¹⁰침략 적인 해충을 관리 하기 위한 기술을 신흥 잠재력 이다. RNAi는 결국 리드는 mRNA에 유전자 발현의 규칙 순서 특정 방식에서 dsRNAs 침입 뿐만 아니라 내 생의 효과적인 posttranscriptional 유전자 입을 용이 하 게 잘 설명된 유전자 규제 메커니즘 레벨^11,12. 간단히, 외 인 dsRNA는 siRNAs에 bidentate nuclease RNase III superfamily의 구성원에 의해 처리 되는 셀에 내 면, 진화론에 벌레, 파리, 식물, 균 류, 포유류^13, 보존 Dicer 호출 ^{14 , 15}.이 21-25의 뉴클레오티드 siRNA duplexes 다음 해제 및 RNAs를 가이드로 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 통합. 이 RISC RNA 복잡 한 Watson 근육 경련 기본적인 쌍 수 하는 보완 대상 mRNA; 이 결국 지도 한다 분열 Argonaute 단백질, 멀티 도메인 단백질 저하 해당 mRNA 및 단백질 번역, 그로 인하여 입을¹⁶ posttranscriptional 유전자로 이어지는 감소는 RNase H-같은 도메인을 포함 하 여 ^{, 17 , 18}.

해충 관리를 위한 RNAi siRNA 통로 활성화 함으로써 dsRNA에서 vivo에서 , 관심사의 유전자를 침묵의 도입을 필요 합니다. 곤충 및 곤충 세포 dsRNA 배달 조직의 RNAi를 유도 하기 위해 사용 된 다양 한 방법이 포함^10,19,^20,21, microinjection²², 사업자 리 같은 몸으로 먹이 ²³, 그리고²⁴다른 기술. RNAi 화재로 unc-22 유전자 발현을 침묵 하 꼬마 선 충 에서 처음 되었고 멜로²⁵, 최저 초파리 melanogaster²⁶에 frizzled 유전자의 표현에 의해 따라. 초기 기능 연구 활용 곤충, Apis mellifera^22,27,²⁸ Acyrthosiphon pisum, Blattella germanica²⁹, dsRNA를 제공 microinjection H. halys³⁰및 (Terenius 그 외 여러분 검토 lepidopteran 곤충 ³¹). microinjection 곤충에 대 한 관심의 사이트를 정확 하 고 정확한 복용량을 제공 하는. 비록 같은 정화 조 자국 농업 biopesticides 개발에서의 실용성을 배제 외상³², 그러므로, 때문에 면역 관련된 유전자의 표정을 유도 수 있습니다.

DsRNA에서 vivo에서 제공 하는 또 다른 방법은입니다 몸을 담근 채, 섭취 또는 흡수 dsRNA의 동물 또는 세포의 dsRNA를 포함 하는 extracellular 매체에서 일반적으로 포함. 효율적으로 침묵 C. 선 충 뿐만 아니라 하류로의 Raf1 (DSOR1) 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 키 니 아 제 (MAPKK)²⁰, 억제 하기 위해 초파리 S2 조직 배양 세포에서 RNAi를 유도 하는 데 사용 되었습니다 젖어 pos-1 진³³. 그러나, 몸으로 사용 하 여 배달 dsRNA microinjection²⁰에 비해 RNAi를 유도 하는 것 덜 효율적입니다. RNAi 중재 씹는 곤충에 입을 인공 한 천 다이어트¹⁰으로 dsRNA를 일으키는 여 서 부 옥수수 rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera)에 먼저 보였다. 이전 보고서는 dsRNA 절지동물³⁴특정 자연 다이어트에 주입을 제공 하는 방법을 요약 있다. 이러한 전달 방법 추가 배달;의 인위적인 수단을 대 등 하 게 효과적일 수 결정 등 어디 동등한 최저 면역 관련 유전자의 dsRNA 혈액 식사 또는 microinjected³⁵를 통해 전달 했다 때 관찰 되었다 체체파리 비행 (Glossina morsitans morsitans)의 경우. 마찬가지로, 꿀 꿀벌^{38,39 뿐만 아니라 밝은 갈색 애플 엄 (Epiphyas postvittana)36, 다이아몬드 나 방 (이용한 배 xylostella) 애벌레37, 방울 통해 dsRNA의 납품} 효율적인 RNAi를 유도. 호스트 식물의 혈관 조직을 통해 전달 해야 합니다 때문에, hemipteran 곤충에 dsRNA의 구두 전달 힘든 때문에 hemipteran에 가장 효과적인 RNAi 실험 dsRNA⁴⁰ 의 주입 활용가. 효과적인 RNAi 또한 ACP와 유리 날개 사격의 명 수 leafhopper (GWSS) Homalodisca vitripennis에서 관찰 되었다: dsRNA 감귤 류와 루트 물 약, 잎을 통해 혈관 조직으로 dsRNA를 흡수 했다 포도 덩굴을 통해 전달 했다 스프레이, 트렁크 주사, 또는 절단^{41,,4243,44,45,46}에 의해 흡수. 이것 또한 dsRNA ACP (2016, 미국 20170211082 A1)에 대 한 첫 번째 특허 귀착되는. SiRNA 나노 입자 등 리 캐리어를 사용 하 여 dsRNA의 납품 부여 안정성, 그리고 전달된의 dsRNA 효능 증가^{23,,4748,49 신흥 빠르게 ,50}. 나노 기반 배달 차량의 생체 외에서 그리고 vivo에서 적당 한 배달 벡터⁵¹로 치료 응용 프로그램 엄청난 잠재력을 얻으며 수 있습니다에 대 한 구체적으로 요약 했다에 대 한 핵 산에 대 한 새로운 클래스. DsRNA에 대 한 배달 차량으로 나노 입자 용 해도, hydrophobicity, 또는 제한 된 bioaccumulation⁵²를 포함 하 여 단점 있지만 적당 한 폴리머 탈출 배달 이러한 단점을 보상 수 있습니다. 개발 및 자체 제공 뉴클레오티드의 사용 이라는 ‘센스 oligonucleotides’, 단일 좌초 RNA/DNA 쌍 신 회로⁴⁶는 등장도 하고있다.

절지동물에 vitellogenesis 키가는 체 지방; Vg 합성의 주요 inducers 복제 제어 과정 및 젊은 호르몬 (JH) 또는 ecdysone 규제, Vg는 결국 Vg 수용 체 중재 된 endocytosis⁵³통해 개발 oocyte에 의해 촬영. Vg은 polypeptides의 그룹 합성 extraovarially vitellin^54,55, 주요 계란 노 른 자 단백질의 개발을 위한 필수 이며 따라서, 재생산 및 노화⁵⁶에 중요 하다. Vg은 nematodes⁵⁷ 에 성공적으로 침묵 되었다 뿐 아니라 꿀벌 (Apis mellifera) 어디 RNAi 중재 Vg의 고갈에서에서 성인과 계란²²에서 관찰 되었다. RNAi 그것의 고갈 같은 관찰 phenotypic 영향으로 이어질 것으로 생각 되었다 때문에 시험 되었다 중재 posttranscriptional 유전자 Vg의 입을 감소 산과 통치, 잠재적으로 BMSB 제어에 도움. JHAMT 유전자 인코딩하는 S-adenosyl-L-메티오닌 (SAM)-종속 JH 산 O-methyltransferase, JH 생 합성 통로⁵⁸의 마지막 단계를 catalyzes. 이 통로 farnesyl 파이 인산 (FPP)는 순차적으로 farnesol에서 farnesoic 산 JHAMT에 의해 JH 메 틸 farnesoate의 변환 다음에 변형 됩니다. 이 통로 곤충 변 태 호르몬^59,,6061에 의해 규제 발달 과정에 맞게 절지동물에 보존 됩니다. B. 모리, JHAMT 유전자 발현 및 Corpora allata에 JH 생 합성 활동 제안 JHAMT 유전자의 transcriptional 억제 JH 생 합성⁵⁸의 종료에 대 한 결정적 이다. 따라서, JHAMT 및 Vg 유전자 RNAi를 사용 하 여 대상된 고갈에 대 한 선정 됐다. RNAi는 ACP와 GWSS의 제어를 위한 감귤 나무에서 또한 시험 되었다. 감귤 나무 dsRNA 루트 물 약을 통해 치료 했다, dsRNAs 곤충 특정 아르기닌 키 (AK) 녹취 록^42,44에 대 한와 잎 스프레이 뿐만 아니라 탭 (트렁크 주사), 줄기. 감귤 나무, 식물 혈관 조직을 통해 효율적인 납품을 나타내는 고 귀착되 었 다 ACP GWSS^41,42, 에서 사망률 증가의 캐노피 온통 dsRNA의 국 소 응용 프로그램 검색 되었습니다. ⁴⁵.

현재 연구에서 우리는 dsRNA 등 치료에 대 한 자연 식단 배달 방법을 확인 했습니다. 새로 개발된 된이 기술은 이후 JHAMT 및 Vg 입을 사용 되었다 mRNA 유전자 특정 dsRNAs BMSB로 nymphs에 사용 하 여 이전⁶²시연. 여기 설명 이러한 새로운 배달 프로토콜 국 소 스프레이 또는 microinjections를 사용 하는 기존 RNA 배달 시스템을 대체 합니다. 야채와 과일, 줄기 탭, 토양에는 억 수 같이 쏟아지는, 및 찰 흙 absorbents에서 사용할 수 있습니다 전달의 dsRNA,이 중국 해충 및 병원 체 관리의 지속적인된 발전에 매우 중요.

Protocol

1. BMSB 양육 표준 실험실 연습와 앞에서 설명한63BMSB 곤충 후면. 유리 공장 (22 ° C) 및 자연 채광에 감귤 꽃 에 ACP (D. citri) 곤충을 올립니다. 성인 ACP를 사용 하 여, 대략 5-7 일에 게시 일수로. 2. 유전자 영역 및 체 외에서 합성 dsRNA의 선택 이전에 게시 transcriptome 프로필32에서 BMSB에 특정 유전자를 ?…

Representative Results

BMSB 4회 탈피 님프에 먹이 통해 야채 중재 dsRNA 배달 분자 biopesticides RNAi를 사용 하 여 침입 곤충 해충에 대 한 개발에 대 한 테스트를 했다. BMSBs 피드로 알려진 메커니즘에 의해 그들의 바늘 같은 stylets를 사용 하 여 입힌 고 플 러쉬, 어떤 작물에 상당한 손상을 초래. 슬림 유기 녹색 콩, P. vulgaris L., 영양소 또는 dsRNA 전달 될 수 있는 비보에 BMSB에 먹이<su…

Discussion

RNAi 입증 유전자 생물학 기능 및 규정, 해충^19,,6869,70, 의 관리에 대 한 활용을 중대 한 잠재력을 탐험을 위한 중요 한 도구 ⁷¹. 디자인 및 특정 곤충 종과 곤충에 해당 dsRNA(s)의 납품의 방법에 입을 위한 적절 한 gene(s)의 선택은 매우 중요 둘 다. 곤충으로 dsRNA를 제공 하기 위한 ?…

Materials

BMSB (H. halys) insects	USDA
ACP (D. citri) insects	USDA
organic green beans	N/A
Citrus plants	USDA
sodium hypochlorite solution	J.T. Baker
green food coloring	McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers	Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture)	Sigma
Primers	IDT DNA
SensiMix SYBR	Bioline
qPCR ABI 7500	Applied Biosystems
Spray bottle	N/A
Parafilm	American Can Company
TaKaRa Ex Taq	Clontech
QIAquick	Qiagen