الاستخدام الأمثل "روبوت مناولة السائل" إجراء "عالية الإنتاجية إلى الأمام الكيميائية الوراثة شاشة" التمويل نبات
Summary
شاشة عالية إنتاجية من الجزيئات الصغيرة الاصطناعية أجريت على أنواع النباتات النموذجية، أعطيت التمويل. هذا البروتوكول، وضعت لروبوت مناولة سائل، ويزيد من سرعة الشاشات الوراثة الكيميائية إلى الأمام، والتعجيل باكتشاف رواية الجزيئات الصغيرة التي تؤثر فسيولوجيا النبات.
Abstract
يجري استخدام علم الوراثة الكيميائية متزايد فك شفرة الصفات في النباتات التي قد تكون المعاندة لعلم الوراثة التقليدية بسبب تكرار الجينات أو الفتك. ومع ذلك، احتمال جزيء صغير الاصطناعية يجري النشطة بيولوجيا منخفضة؛ ولذلك، يجب اختبار آلاف جزيئات من أجل العثور على تلك التي تهم. التعامل مع الروبوتات نظم مصممة للتعامل مع إعداد كبيرة من العينات، وزيادة السرعة التي يمكن فرز مكتبة كيميائية بالإضافة إلى التقليل من توحيد خطأ السائل. لتحقيق شاشة الفائق الوراثة كيميائية إلى الأمام لمكتبة 50,000 الجزيئات الصغيرة على التمويل نبات (نبات)، بروتوكولات استخدام سائل الأقنية أعلى هيئة معالجة روبوت وضعت التي تتطلب الحد الأدنى مشاركة فني. تم اكتشاف الجزيئات الصغيرة 3,271 مع هذه البروتوكولات، التي تسببت في التعديلات المظهرية مرئية. مركبات 1,563 الناجمين عن جذور قصيرة والتلون مركبات 1,148 غيرت والمركبات 383 تسبب جذر الشعر والتعديلات الأخرى، غير مصنفة، وإنبات 177 مركبات تحول دون.
Introduction
في السنوات ال 20 الماضية الباحثين في مجال البيولوجيا النباتية خطت باستخدام نهج علم الوراثة الكيميائية، على حد سواء إلى الأمام أو عكس، تحسين فهمنا تخليق جدار الخلية الحيوي، سيتوسكيليتون، وتخليق الهرمون الحيوي وإشارات، جرافيتروبيسم والمرضية والحيوي البيورين واندوميمبراني الاتجار1،2،3،،من45. تستخدم تقنيات علم الوراثة الكيميائية إلى الأمام يمكن تحديد تعمل لمصلحة ويسمح للباحثين لفهم قد أسس عمليات خاصة. على العكس من ذلك، يسعى علم الوراثة الكيميائية عكس المواد الكيميائية التي تتفاعل مع بروتين سلفا هدف6. وقد أعطيت في طليعة هذه الاكتشافات في علم الأحياء النباتية للجينوم قليل، المعينة، والمشروح. أنها فترة قصيرة جيل، وهناك عدة أسطر المسخ/مراسل لتسهيل عملية تحديد إليه سوبسيلولار الشاذة7.
هناك اثنين من الاختناقات التي تبطئ التقدم إلى الأمام شاشات الجينية الكيميائية الأولية عملية الفرز وتحديد هدف مجمع الفائدة8. معونة رئيسية في زيادة سرعة التحديد جزيء صغير هو استخدام التشغيل الآلي للمكاتب والمعدات الآلية9. وكان لها دور أساسي في دفع عجلة التقدم في العلوم البيولوجية10الروبوتات مناولة السائل هي أداة ممتازة للتعامل مع مكتبات كبيرة من الجزيئات الصغيرة. ويهدف البروتوكول المعروضة هنا لتخفيف حدة عنق الزجاجة المرتبطة بعملية الفحص، مما يتيح تحديد النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة بمعدل سريع. هذا الأسلوب يقلل من عبء العمل والوقت باسم المشغل بينما تتناقص أيضا التكلفة الاقتصادية للمحقق المبدأ.
وحتى الآن عقدت المكتبات الكيميائية الأكثر حلل بين 10 آلاف و 20,000 المركبات، مع ما يصل إلى 000 150، وبعضها مع عدد قليل من 709،11،،من1213،14، بعض 15 , 16-تم تنفيذ بروتوكول عرض هذه الوثيقة على مكتبة جزيء صغير من مركبات 50,000 (انظر الجدول للمواد)، وواحدة من الوراثة الكيميائية إلى الأمام أكبر شاشات أجريت على نبات حتى الآن. يناسب هذا البروتوكول مع الاتجاه الحالي نحو زيادة الكفاءة والسرعة فيما يتعلق بعلم الوراثة الكيميائية إلى الأمام، لا سيما فيما يتعلق باكتشاف مبيدات الأعشاب، واكتشاف المبيدات الحشرية، ومبيد للفطريات اكتشاف والمخدرات الاكتشاف، وبيولوجيا السرطان17 ،،من1819،،من2021. لو نفذت هنا مع نبات، هذا البروتوكول، يمكن بسهولة أن تتكيف الثقافات الخلية والجراثيم والحشرات حتى يحتمل أن تكون في المتوسطة السائل داخل 96-384-أو لوحات 1536-جيدا. نظراً لصغر حجمها، نبات قابلة للفرز في لوحات جيدا 96. غير أن توزيع البذور بالتساوي بين الآبار يمثل تحديا. اليد بذر دقيقة لكن العمالة المكثفة، وعلى الرغم من أن هناك أجهزة مصممة للاستغناء عن البذور في لوحات 96، حسنا، أنها مكلفة للشراء. هنا، نحن إظهار كيف هذه الخطوة يمكن التحايل عليها بمجرد خسارة صغيرة بدقة.
وكان الهدف العام لهذا الأسلوب جعل فحص مكتبة كيميائية كبيرة ضد نبات أكثر قابلية للإدارة، دون المساس بدقة، عن طريق استخدام الروبوت مناولة السائل. يحسن استخدام هذا الأسلوب كفاءة الباحث بتقليل الوقت المستغرق لإكمال إدارة سلسلة تمييع الأولية والشاشات المظهرية اللاحقة، مما يسمح التصور السريع للعينات تحت مجهر تشريح، والسريع تعريف الرواية النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة. ويصور الشكل 1 النتائج الرئيسية لهذا البروتوكول في 4 خطوات.
رقم 1: سير العمل عموما من الشاشة إلى الأمام علم الوراثة الكيميائية. نظرة عامة على البروتوكول لوصف بالتفصيل لكل خطوة من الخطوات الرئيسية 4. 1: تلقي “المكتبة الكيميائية”، 2: مما يجعل “المكتبة تمييع”، 3: صنع “لوحات الفحص”، و 4: حضانة، وتصور “لوحات الفحص”. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول لمساعدة الباحثين في إنجاز شاشة الوراثة كيميائية إلى الأمام على نبات. نحن نقدم نتائج تمثيلية من شاشة مركبات 50,000 (الشكل 2 و الشكل 3)، واحدة من أكبر الشاشات الوراثة الكيميائية إلى الأمام أجريت على نبات حتى9،،من<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر جوزيف جو ستورك، ريتشموند ميتشل، جولو مراد اليحصبي، واندريا سانشيز للمناقشة البناءة والهامة. الدكتور بيري شارين للصور الفوتوغرافية المظهرية. ويستند إلى العمل المدعوم من “المؤسسة الوطنية للعلوم” تحت الاتفاق التعاوني رقم 1355438 هذه المواد.
Materials
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
Riferimenti
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- . Seed Handling Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013)
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
